Ágar XLD e ágar Hektoen: para que serve cada um, leitura das colônias e quando usar para Salmonella e Shigella

O ágar XLD (xilose lisina desoxicolato) e o ágar Hektoen entérico (HE) são meios seletivos e diferenciais para isolar Salmonella e Shigella em meio a uma microbiota entérica abundante. Os dois inibem gram-positivos e mostram, pela cor da colônia e pelo centro preto de H₂S, quem fermenta açúcares e quem não fermenta. A diferença está no princípio: o XLD separa Salmonella pela descarboxilação da lisina; o HE separa pela fermentação de lactose, sacarose e salicina, com dois corantes. Na ficha técnica do Ágar XLD da Sora, o uso declarado é o isolamento seletivo e a contagem de Salmonella Typhi e de outras salmonelas em fezes, alimentos, laticínios e água; na do Ágar Hektoen Entérico, o isolamento diferencial e seletivo de Salmonella e Shigella em amostras entéricas.

Nenhum dos dois identifica espécie: a colônia suspeita segue para triagem bioquímica e sorologia.

Ágar XLD: princípio e composição

O XLD foi descrito por Taylor em 1965, originalmente para melhorar o isolamento de Shigella. A lógica é uma sequência de reações de pH lidas pelo vermelho de fenol (amarelo em meio ácido, vermelho em meio alcalino). Segundo a ficha da Sora:

• Xilose (3,50 g/L): fermentada pela maioria das enterobactérias, exceto Shigella e Providencia, que por isso formam colônias vermelhas.
• L-lisina (5,00 g/L): quando a xilose se esgota, Salmonella descarboxila a lisina e o meio volta a ficar alcalino: a colônia fica vermelha.
• Lactose e sacarose (7,50 g/L cada): em excesso, garantem que outros lisina-positivos que fermentam esses açúcares continuem ácidos (amarelos), sem reverter.
• Tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal: revelam o H₂S como precipitado preto, só em condição alcalina; a acidez bloqueia a reação.
• Desoxicolato de sódio (2,50 g/L): inibe gram-positivos.

O meio pronto é vermelho, límpido a muito levemente opalescente, com pH 7,4 ± 0,2 a 25 °C.

Ágar Hektoen entérico: princípio e composição

O HE foi descrito por King e Metzger em 1968, com mais peptona para compensar o efeito inibitório da bile sobre os patógenos. Pela ficha da Sora:

• Mistura de sais biliares (9,00 g/L), azul de bromotimol e fucsina ácida: inibem gram-positivos.
• Lactose e sacarose (12,00 g/L cada) e salicina (2,00 g/L): três carboidratos fermentáveis. Quem fermenta qualquer um deles acidifica a colônia, que fica laranja a salmão; quem não fermenta fica azul-esverdeada, que é o caso de Salmonella e Shigella.
• Tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal: o H₂S precipita como sulfeto de ferro e dá centro preto à colônia.
• Peptona proteose (12,00 g/L) e extrato de levedura: nutrientes.

O meio pronto é verde, límpido a levemente opalescente, com pH 7,5 ± 0,2 a 25 °C.

Leitura das colônias no XLD e no Hektoen

Leia colônias bem isoladas; a semeadura por esgotamento é o que torna a cor confiável. Os aspectos abaixo vêm do controle microbiológico das fichas da Sora (cepas de referência a 35–37 °C); isolados de campo podem variar.

Na prática: no XLD, vermelho com centro preto sugere Salmonella e vermelho sem centro preto sugere Shigella; no HE, azul-esverdeado com centro preto sugere Salmonella e azul-esverdeado sem centro preto sugere Shigella. Amarelo (XLD) e laranja ou salmão (HE) indicam fermentadores, em geral microbiota acompanhante.

Quando usar o XLD, o Hektoen ou os dois

A escolha é do método de referência, não do analista.

Alimentos e rações, ISO 6579-1. A norma prevê pré-enriquecimento em Água Peptonada Tamponada, enriquecimento seletivo em Caldo RVS e Caldo MKTTn e plaqueamento em XLD como primeiro meio, mais um segundo meio de isolamento escolhido pelo laboratório, complementar ao XLD. O HE é uma das opções para esse segundo meio. É o método de referência usado para Salmonella na verificação dos padrões da IN 161; o fluxo completo está em análise microbiológica de alimentos.

Alimentos, FDA BAM capítulo 5. O BAM semeia cada caldo de enriquecimento seletivo em três meios ao mesmo tempo: ágar sulfito de bismuto, HE e XLD. O sulfito de bismuto é reincubado por mais um dia, e as colônias suspeitas seguem para TSI e LIA.

Farmacêutico e cosmético, USP <62> e Ph. Eur. 2.6.13. Na pesquisa de Salmonella em produtos não estéreis, o enriquecimento em Caldo Rappaport-Vassiliadis é semeado em XLD; o HE não faz parte desse método.

Shigella em alimentos, ISO 21567. A norma usa três meios de plaqueamento: MacConkey, XLD e HE. Como as fichas avisam que algumas cepas crescem pouco em cada meio, semear em mais de um aumenta a chance de recuperar Shigella.

Microbiologia clínica (pesquisa e ensino). Em fezes, os dois meios costumam ser usados ao lado de um meio de baixa seletividade, como o MacConkey (veja o guia do ágar MacConkey), ou do ágar SS (veja o guia do ágar SS). A linha da Sora é para uso laboratorial profissional e não se destina a diagnóstico in vitro.

Preparo: os dois não vão à autoclave

Ágar XLD (ficha): suspender 56,68 g em 1000 mL de água destilada, aquecer com agitação frequente até a ebulição, não autoclavar nem superaquecer, transferir imediatamente para banho-maria a 50 °C e verter em placas estéreis. A ficha recomenda não preparar grandes volumes, porque o aquecimento prolongado forma precipitado; uma leve precipitação é própria do meio e não afeta o desempenho.

Ágar Hektoen (ficha): suspender 76,67 g em 1000 mL, aquecer até a ebulição para dissolver, não autoclavar, resfriar a 45–50 °C, homogeneizar e verter. A ficha avisa que o calor excessivo altera os ingredientes. O pó pode provocar reação alérgica na pele: use luvas e evite inalar.

Os dois meios preparados ficam entre 2 e 8 °C, e o pó, abaixo de 30 °C. Detalhes gerais em como preparar meio de cultura desidratado. Como não há autoclavagem, trabalhe com vidraria limpa e verta em ambiente controlado; a liberação de cada lote preparado segue o teste de promoção de crescimento.

Limitações e armadilhas de leitura

1. Proteus imita Salmonella. A ficha do XLD registra que algumas cepas formam colônias com centro preto, e a do HE, que Proteus pode se assemelhar a salmonelas ou shigelas.
2. Nem toda Salmonella tem centro preto. Pela ficha do XLD, S. Paratyphi A, S. Choleraesuis, S. Pullorum e S. Gallinarum podem formar colônias vermelhas sem centro preto, parecidas com Shigella.
3. Vermelho no XLD não é exclusivo de enteropatógenos. Pseudomonas e Providencia também podem formar colônias vermelhas.
4. Cepas exigentes podem crescer pouco em qualquer dos dois meios; por isso os métodos usam mais de um meio de plaqueamento.
5. A cor é presuntiva. Confirme com provas bioquímicas e sorologia.

Todos os meios para enriquecimento, isolamento e triagem estão nas páginas de Salmonella e Shigella, com composição, preparo e controle microbiológico publicados na ficha de cada um. O Ágar XLD e o Ágar Hektoen Entérico da Sora saem com certificado de análise por lote; o lote que você prepara continua sendo liberado pelo seu laboratório. Para montar o conjunto de meios do seu método, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas