Provas bioquímicas em microbiologia: TSI, LIA, SIM, citrato e ureia para identificar bactérias

Provas bioquímicas são testes que revelam, por mudança de cor, gás, precipitado ou crescimento, uma atividade metabólica da bactéria: fermentar açúcares, produzir sulfeto de hidrogênio (H₂S), descarboxilar ou desaminar aminoácidos, usar citrato, hidrolisar ureia, formar indol ou se mover no meio. Nenhuma prova identifica sozinha. O que identifica é o perfil de uma bateria semeada a partir de colônia pura. Para bacilos gram-negativos entéricos, a bateria clássica reúne TSI ou KIA, LIA, SIM, citrato de Simmons, ureia e descarboxilases, precedida de catalase e oxidase. A identificação definitiva ainda exige sorologia ou outro método de confirmação.

Por que as provas bioquímicas funcionam

Cada meio traz um substrato e um indicador. Se a bactéria tem a enzima, o produto muda o pH ou forma um composto visível:

• Fermentação de açúcares: o ácido vira o indicador (vermelho de fenol fica amarelo).
• H₂S: o tiossulfato é reduzido a sulfeto, que reage com ferro e forma precipitado preto.
• Descarboxilação: a lisina vira cadaverina, que alcaliniza o meio; a desaminação, típica de Proteus, dá outra cor.
• Citrato e urease: o uso do citrato como única fonte de carbono e a liberação de amônia pela urease sobem o pH.
• Indol: a triptofanase degrada o triptofano a indol, revelado por p-dimetilaminobenzaldeído (protocolo da ASM).
• Motilidade: em meio semissólido, a bactéria móvel cresce para fora da picada.

Quando usar: depois do isolamento, com colônia pura

As provas entram depois do isolamento em meio seletivo ou diferencial, a partir de colônia suspeita bem separada. A ficha do TSI é explícita: cultura mista gera leituras irregulares.

1. Faça Gram, catalase e oxidase para escolher a bateria.
2. Toque o centro de uma colônia isolada com agulha reta.
3. Semeie o Ágar Citrato de Simmons primeiro, ou flambe a agulha antes dele: nutrientes arrastados de outro meio dão falso-positivo, segundo a ficha.
4. Registre o tempo de incubação de cada tubo.

Para Salmonella em alimentos, o FDA BAM (capítulo 5) usa TSI e LIA em conjunto, a 35 °C por 24 ± 2 h. A ISO 6579-1 inclui TSI, ágar ureia e meio de L-lisina descarboxilase na confirmação bioquímica, seguidos da sorologia. Veja os meios para Salmonella.

Provas rápidas: catalase e oxidase

Catalase detecta a enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio, com liberação de bolhas. Pelo protocolo da ASM, ela separa Micrococcaceae (positivas) de Streptococcaceae (negativas): é o primeiro passo nas provas bioquímicas para gram-positivas, com Staphylococcus catalase-positivo e Streptococcus catalase-negativo. Veja os meios para Staphylococcus.

Oxidase detecta a citocromo c oxidase: o reagente de tetrametil-p-fenilenodiamina forma azul de indofenol, azul-escuro ou púrpura (ASM). Nas provas bioquímicas para gram-negativas, ela separa as enterobactérias, oxidase-negativas, de não fermentadores como Pseudomonas aeruginosa.

TSI e KIA: fermentação, gás e H₂S num só tubo

O Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) tem dextrose a 1 g/L, lactose e sacarose a 10 g/L cada, vermelho de fenol, sulfato ferroso e tiossulfato. O Ágar Ferro Dois Açúcares de Kligler (KIA) segue a mesma lógica sem sacarose. Com tão pouca glicose, quem fermenta só ela acidifica pouco: o ápice, em aerobiose, volta a alcalinizar, e a base, em anaerobiose, fica ácida.

Preparo (fichas): TSI a 64,52 g/L e KIA a 57,52 g/L, pH 7,4 ± 0,2, 121 °C por 15 minutos, solidificados inclinados com fundo de cerca de 1 polegada. A ficha do KIA pede meio recém-preparado e veta tubo com tampa de rosca.

Semeadura: com agulha, pique a base até o fundo, retire e estrie o ápice. A ficha do TSI proíbe a alça na picada, porque a ruptura do ágar simula gás. Incube com tampa frouxa, para o ar manter o ápice alcalino. As fichas leem a 35–37 °C em 18–48 h; o protocolo de Lehman (Microbe Library), a 37 °C em 18 a 24 h.

TSI ou KIA? A sacarose do TSI separa fermentadores de sacarose que não fermentam lactose, como alguns Proteus e Citrobacter spp. Em troca, a ficha registra que o H₂S pode aparecer no KIA e não no TSI, porque a sacarose pode suprimir a produção de H₂S, e que nem toda Salmonella H₂S-positiva é positiva no TSI.

LIA: descarboxilação ou desaminação da lisina

O Ágar Lisina Ferro (LIA) combina lisina (10 g/L), glicose (1 g/L), indicador de H₂S e púrpura de bromocresol, amarela em pH ≤ 5,2 e púrpura em pH ≥ 6,8. Preparo: 34,56 g/L, pH 6,7 ± 0,2, 121 °C por 15 minutos, inclinado com fundo profundo. Pique a base, estrie o ápice e leia a 35–37 °C em 18–24 h (ficha).

A ficha avisa que Salmonella Paratyphi A não descarboxila a lisina (K/A), que alguns Proteus H₂S-positivos não enegrecem o LIA, por isso o uso junto do TSI, e que Morganella morganii pode exigir incubação mais longa.

SIM: sulfeto, indol e motilidade

O Meio SIM é semissólido (ágar 3 g/L) e rico em peptona, fonte de triptofano. Preparo: 36,23 g/L, pH 7,3 ± 0,2, 121 °C por 15 minutos, tubos em pé. Semeie com uma picada reta no centro e incube a 35–37 °C por 18–24 h.

Leia motilidade (crescimento afastado da picada, com turvação) e H₂S (enegrecimento) antes de adicionar o reagente de Kovács; o indol positivo forma anel vermelho na superfície.

Citrato de Simmons: citrato como única fonte de carbono

O citrato de sódio é a única fonte de carbono e o fosfato monoamônico, a única de nitrogênio. Quem usa os dois cresce e alcaliniza o meio, que passa de verde para azul (azul de bromotimol). Preparo: 24,28 g/L, pH 6,8 ± 0,2, 121 °C por 15 minutos; a ficha pede água com pH entre 6,5 e 7,0, senão a cor inicial se desvia. Estrie levemente e incube a 35–37 °C por 18–24 h; alguns positivos precisam de 48 h ou mais.

Com indol, vermelho de metila e Voges-Proskauer (no Caldo VM-VP), o citrato compõe o IMViC, que diferencia Escherichia coli do grupo aerogenes.

Ureia de Christensen: urease

A amônia vira o vermelho de fenol de amarelo (pH 6,8) para rosa-avermelhado (pH 8,1). Há duas bases: o Ágar Base Ureia de Christensen (autoclavável), para isolados de amostras clínicas, alimentos e água, e o Ágar Base Ureia de Christensen (ISO 6579-1), com composição e critérios de desempenho de acordo com a ISO 6579-1:2017. Nas duas: 24,01 g em 950 mL, 115 °C por 20 minutos, resfriar a 45–50 °C e adicionar assepticamente 50 mL de solução estéril de ureia a 40%. Não reaqueça: a ureia se decompõe com facilidade.

Proteus urease-positivo vira o meio nas primeiras 2 a 6 horas; Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter urease-positivos podem levar 3 a 5 dias. Alcalinização tardia pode vir do consumo de peptona (ex.: P. aeruginosa); na dúvida, faça um controle com o meio sem ureia.

Descarboxilases: caldo lisina e base de Moeller

O Caldo Lisina Descarboxilase (14,02 g/L, pH 6,8 ± 0,2) vai em 5 mL por tubo, a 121 °C por 15 minutos, coberto com 2 a 3 mL de óleo mineral estéril. A glicose fermentada deixa o meio amarelo; o ácido ativa a descarboxilase, a cadaverina alcaliniza e o meio volta a púrpura. Amarelo persistente é negativo. Use inóculo leve e não encerre a leitura em 24 h: algumas cepas levam até 4 dias.

Para lisina, arginina e ornitina, o Caldo Base de Moeller para Descarboxilase recebe 10 g/L do L-aminoácido (2% se DL), pH 6,0 ± 0,2, 121 °C por 10 minutos e óleo mineral; com ornitina, reajuste o pH. Um tubo de base sem aminoácido, semeado junto, ajuda a confirmar que o púrpura veio da descarboxilação.

Tabela-resumo: perfis das cepas de referência

Perfis declarados no controle microbiológico das fichas técnicas da Sora. Isolados de campo variam.

n.d.: cepa fora do controle da ficha desse meio. No KIA, *Proteus vulgaris ATCC 6380 dá K/A, sem gás, com H₂S.

As fichas mostram variação dentro de Salmonella: S. Typhi ATCC 6539 é K/A sem gás e com H₂S no TSI e citrato-negativa; S. Paratyphi A é H₂S-negativa e lisina-negativa.

Limitações

• Perfis atípicos. Há Salmonella H₂S-negativa e Salmonella fermentadora de lactose ou sacarose, com ápice amarelo no TSI; por isso a triagem bioquímica sozinha não basta para descartar um isolado suspeito.
• Tempo de leitura. Ureia lida tarde, descarboxilase lida cedo e citrato encerrado em 24 h erram nos dois sentidos.
• Sistemas comerciais (galerias miniaturizadas, painéis automatizados) comparam o perfil com um banco de dados e valem para os táxons validados pelo fabricante do sistema.
• Confirmação. Para Salmonella, a ISO 6579-1 e o BAM completam a bioquímica com sorologia (antígenos O, H e Vi); métodos moleculares e espectrometria de massas também são usados.
• Controle do lote. A Sora emite certificado de análise por lote, mas o meio reidratado no seu laboratório é liberado por você, com cepas de referência: veja o teste de promoção de crescimento e como preparar meio de cultura desidratado.

Monte a bateria do seu laboratório

Todos os meios citados estão em Identificação bioquímica, com composição, preparo e controle microbiológico na ficha técnica. Veja também os meios para enterobactérias e, para ensino e pesquisa, a seleção de microbiologia clínica (pesquisa e ensino). Os produtos são para uso laboratorial profissional, sem finalidade diagnóstica in vitro. Para definir a bateria e as cepas de controle do seu POP, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas