Teste de promoção de crescimento em meios de cultura: como fazer segundo a ISO 11133 e a Farmacopeia

O teste de promoção de crescimento (growth promotion test) demonstra que um lote de meio de cultura recupera microrganismos em baixa contagem antes de ser usado em análise. Sem ele, um resultado negativo não diz nada: a amostra pode estar limpa ou o meio pode simplesmente não sustentar crescimento. Duas famílias de documentos regem o ensaio: a ISO 11133, para alimentos, ração e água, e os capítulos harmonizados das farmacopeias (USP <61>, <62> e <71>, Ph. Eur. 2.6.12, 2.6.13 e 2.6.1), para produtos farmacêuticos. No Brasil, a referência farmacêutica é a Farmacopeia Brasileira, 8ª edição, em vigor desde 1º de julho de 2026.

Quem precisa testar, e com que frequência

A resposta curta: cada lote preparado no laboratório. A USP é explícita nos três capítulos: deve-se testar cada lote de meio pronto e cada lote preparado a partir de meio desidratado ou de ingredientes. Quem compra meio desidratado e o reidrata, esteriliza e distribui está produzindo um lote novo, e é esse lote que precisa ser qualificado.

A ISO 11133 segue a mesma lógica. A introdução da norma pede ensaios suficientes para demonstrar a aceitabilidade de cada lote, a adequação ao uso (fit for purpose) e a consistência dos resultados. O fabricante do meio deve fornecer a documentação do produto (ficha técnica, lote, pH-alvo, conservação e validade), e critérios mínimos bem definidos tendem a reduzir o volume de testes no laboratório usuário, mas não transferem a ele a responsabilidade pelo lote que ele mesmo prepara.

Na prática, o controle de qualidade de meios de cultura tem duas camadas:

1. Físico-química, a cada lote: cor, aspecto, limpidez e pH após a esterilização, comparados à especificação da ficha técnica.
2. Microbiológica, a cada lote: promoção de crescimento e, nos meios seletivos ou diferenciais, inibição e reações características.

Cepas de referência e manutenção

As normas indicam cepas rastreáveis a coleções de cultura. As farmacopeias citam números ATCC (ou equivalentes de outras coleções); a ISO 11133 lista as cepas de controle de cada meio pelo número WDCM nos anexos de critérios.

Para meios farmacêuticos, a USP <61> indica estas cepas e condições:

A USP <62> acrescenta as cepas dos ensaios de microrganismos específicos, como Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium ATCC 14028 e Clostridium sporogenes ATCC 11437 ou ATCC 19404.

Dois cuidados valem para qualquer norma:

• Sistema de lote-semente. A USP <61> limita as culturas de trabalho a, no máximo, cinco passagens a partir do lote-semente original. Passagens em excesso selecionam variantes e mascaram falhas do meio.
• Suspensões frescas. As suspensões de teste são preparadas em solução tampão de cloreto de sódio-peptona pH 7,0 ou tampão fosfato pH 7,2 e usadas em até 2 horas, ou em até 24 horas se mantidas entre 2 e 8 °C.

Inóculo e critérios de aceitação

Na farmacopeia (USP <61>, <62> e Ph. Eur. 2.6.12, 2.6.13)

O inóculo de promoção de crescimento é pequeno: não mais que 100 UFC por meio. O objetivo é desafiar o meio com uma carga próxima da que ele encontrará numa amostra real.

• Meio sólido: o crescimento não pode diferir por um fator maior que 2 do valor calculado para o inóculo padronizado. É comum ler esse critério como recuperação entre 50% e 200% da contagem do inóculo.
• Meio líquido: deve haver crescimento claramente visível, comparável ao obtido com um lote anteriormente testado e aprovado.
• Propriedades inibitórias (USP <62>): o meio seletivo é desafiado com pelo menos 100 UFC do microrganismo não alvo e não pode haver crescimento, com incubação pelo tempo mais longo previsto.
• Propriedades indicativas (USP <62>): colônias e reações (cor, halo, precipitação) devem ser comparáveis às de um lote aprovado.

No ensaio de esterilidade (USP <71> e Ph. Eur. 2.6.1)

Cada lote de meio fluido de tioglicolato e de caldo caseína-soja é inoculado com não mais que 100 UFC, em porções separadas para cada cepa, com incubação de até 3 dias para bactérias e até 5 dias para fungos:

• Meio fluido de tioglicolato: Clostridium sporogenes ATCC 19404, P. aeruginosa ATCC 9027 e S. aureus ATCC 6538.
• Caldo caseína-soja: A. brasiliensis ATCC 16404, B. subtilis ATCC 6633 e C. albicans ATCC 10231.

O meio é aceito se houver crescimento claramente visível de cada cepa. Para o ensaio de esterilidade, a Sora oferece o Meio Fluido de Tioglicolato (USP) e o Caldo Triptona de Soja (TSB), ambos desidratados.

Na ISO 11133: a produtividade do meio

A ISO 11133 trabalha com três conceitos definidos no texto da norma:

• Produtividade: nível de recuperação do microrganismo-alvo sob condições definidas.
• Seletividade: grau de inibição do microrganismo não alvo num meio seletivo.
• Especificidade (eletividade): demonstração de que os não alvos não exibem as mesmas características visuais do alvo.

Nos meios sólidos de contagem, a produtividade do meio é expressa pela razão de produtividade (PR): a contagem obtida no meio em teste dividida pela contagem no meio de referência, inoculados com a mesma suspensão. O meio de referência é, em geral, não seletivo e de desempenho conhecido; a própria norma cita o ágar triptona de soja como exemplo. Para meio não seletivo, o critério é PR ≥ 0,7: a ISO 4833-1, por exemplo, exige PR ≥ 0,7 do ágar padrão para contagem frente ao ágar triptona de soja, com E. coli, Bacillus subtilis subsp. spizizenii e S. aureus como cepas de controle. Para meio seletivo comparado a uma referência não seletiva, o critério usual é PR ≥ 0,5. O valor que vale é sempre o da tabela do meio específico, na ISO 11133 ou na norma do método. Meios de enriquecimento e ensaios qualitativos usam escalas de crescimento e inibição definidas nos anexos.

Se a sua rotina usa TSA como meio de referência, o Ágar Triptona de Soja (TSA) da Sora tem composição, pH e preparo publicados na ficha técnica, assim como o Ágar Padrão para Contagem (PCA). Para leveduras e bolores, o Ágar Sabouraud Dextrose cumpre o mesmo papel.

Passo a passo resumido

1. Prepare o lote conforme a ficha técnica e registre a massa pesada, o volume, o ciclo de autoclave e o pH final.
2. Faça o controle físico-químico (cor, limpidez e pH) antes de investir em microbiologia.
3. Prepare as suspensões a partir de culturas de trabalho dentro do limite de passagens.
4. Confirme o inóculo semeando a mesma suspensão no meio de referência ou num lote aprovado; esse é o denominador do cálculo.
5. Inocule o lote novo, em duplicata quando possível, incluindo os não alvos nos meios seletivos.
6. Incube pelo tempo e na temperatura da norma: o mais curto previsto para promoção de crescimento, o mais longo para inibição.
7. Avalie pelo critério aplicável (fator de 2, comparação visual ou PR) e libere ou reprove o lote.
8. Mantenha um controle negativo sem inóculo para confirmar a esterilidade do lote.

Registros que a auditoria vai pedir

O teste só vale se puder ser reconstruído.

Para cada lote de meio, registre:

• nome do meio, lote do fabricante, validade do pó e lote interno preparado;
• data de preparo, parâmetros de esterilização e resultado físico-químico;
• cepas usadas, coleção de origem, número de passagem e data da suspensão;
• inóculo real em UFC, contagens ou leituras obtidas e critério aplicado;
• decisão (aprovado ou reprovado), analista, revisor e data.

Tendências ao longo dos lotes, como PR caindo lote a lote, costumam antecipar problemas de armazenamento do pó, de sobreaquecimento ou de água de preparo.

O que a ficha técnica da Sora informa

A Sora fornece apenas meios desidratados; o lote pronto para uso é produzido no seu laboratório e, por isso, a promoção de crescimento desse lote é feita por você. A ficha técnica de cada produto traz composição por litro, modo de preparo e conservação, além de um bloco de controle de qualidade em duas partes:

• Físico-química: cor e aspecto do pó; pH, cor e limpidez do meio após a esterilização. É a especificação da primeira etapa.
• Microbiológica: as cepas de referência (ATCC) e o crescimento esperado de cada uma, com temperatura e tempo de incubação. Em vários meios, a ficha informa também o inóculo (50–100 UFC) e a recuperação esperada (≥ 70%), como no Ágar Sabouraud Dextrose e no PCA.

Esses dados ajudam a escolher as cepas e a definir o critério do seu plano, mas não substituem o teste do lote que você prepara: o critério que vale é o da norma do seu ensaio.

Consulte o catálogo de meios de cultura ou a seleção para aplicação farmacêutica e esterilidade. Para montar o plano de controle de qualidade de meios de cultura do seu laboratório, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas