Semeadura por esgotamento: técnica de estrias para isolar colônias, passo a passo

A semeadura por esgotamento, ou técnica de estrias, consiste em espalhar o inóculo na superfície do ágar com a alça, em estrias sucessivas, de modo que a carga de células diminua a cada passada até sobrarem células isoladas. Cada uma dá origem a uma colônia separada, que o protocolo da American Society for Microbiology (ASM) descreve como um clone derivado de uma única célula precursora. É o método-padrão para obter cultura pura a partir de uma amostra mista.

O método mais usado é o de quatro quadrantes. Ele exige pouca coisa: placa seca, alça estéril a cada quadrante e nunca voltar ao inóculo inicial.

Para que serve a semeadura por esgotamento

O objetivo é o isolamento de colônias. Na rotina, ele aparece em quatro situações:

• Isolar microrganismos de amostra mista (alimento, água, produto, material clínico) para identificação.
• Purificar uma cultura suspeita de contaminação.
• Conferir a pureza antes de provas bioquímicas, antibiograma ou preparo de suspensão padronizada.
• Repicar cepas de referência usadas no controle de qualidade, como as do teste de promoção de crescimento.

Colônia isolada também é a condição para ler morfologia, cor e reações em meios diferenciais. Em crescimento confluente essas características se perdem.

Materiais necessários

• Placa com o meio adequado, seca e em temperatura ambiente. O tutorial de técnicas de plaqueamento do Journal of Visualized Experiments (JoVE) pede placas totalmente secas, sem condensação na tampa. Placas guardadas a 4 °C devem sair da geladeira de algumas horas a um dia antes e secar em pilhas pequenas, de duas a três. A ficha do ágar MacConkey da Sora traz a mesma exigência: a superfície do meio deve estar seca no momento da inoculação.
• Alça de semeadura. A metálica é flambada até ficar rubra e resfriada antes de tocar o inóculo. A descartável estéril dispensa a chama e se usa uma nova por quadrante, o que é comum em cabine de segurança biológica. A alça calibrada, que entrega um volume conhecido, é a escolha quando a semeadura também precisa ser semiquantitativa; para isolar colônias, ela não é obrigatória.
• Bico de Bunsen ou microincinerador, para alças metálicas.
• Marcador, para identificar a placa pela base, e não pela tampa.

Uma placa só fica bem semeada se o meio foi bem preparado. Pesagem, esterilização, temperatura para verter e armazenamento das placas estão em como preparar meio de cultura desidratado.

Passo a passo: semeadura em placa por quatro quadrantes

1. Identifique a placa na base (amostra, meio, data) e imagine-a dividida em quatro setores.
2. Carregue a alça. Toque de leve uma colônia ou retire uma alçada de caldo. O tutorial do JoVE admite também 5 a 10 µL de caldo dispensados com micropipeta.
3. Quadrante 1, o inóculo. Faça estrias de vaivém bem próximas, da borda em direção ao centro, cobrindo cerca de um quarto da placa. É aqui que fica a maior parte do material, e o crescimento esperado é confluente.
4. Esterilize ou troque a alça e gire a placa 90°.
5. Quadrante 2. Encoste a alça no fim das estrias do quadrante 1, arraste algumas vezes por elas e siga em zigue-zague pelo novo setor, sem voltar. O crescimento esperado ainda é denso, com as primeiras colônias distinguíveis nas pontas.
6. Quadrante 3. Esterilize ou troque a alça, gire mais 90° e repita, partindo apenas do quadrante 2. Aqui as colônias começam a se separar.
7. Quadrante 4. Mesmo procedimento, partindo do quadrante 3 e sem tocar o quadrante 1. Termine com um zigue-zague em direção ao centro da placa. É nesse setor que devem surgir as colônias isoladas.
8. Tampe, inverta e incube nas condições do método.

A alça corre paralela à superfície, com pressão leve: ela desliza sobre o ágar sem riscá-lo.

Variações: três quadrantes (estria em T) e estria contínua

A estria em T divide a placa em três setores e segue a mesma lógica de diluição sucessiva. O protocolo da ASM a apresenta como a forma de três setores mais usada hoje. Ela funciona bem com inóculo moderado, mas dilui menos que a de quatro quadrantes.

Na estria contínua, a alça percorre a placa inteira em zigue-zague, sem esterilizar entre setores. É útil para inóculo pequeno, como swab ou amostra pouco concentrada, e para conferir rapidamente a pureza de uma cultura. Com inóculo carregado, raramente dá colônias isoladas.

Incubação invertida: por quê

A placa vai à estufa de tampa para baixo porque a condensação que se forma na tampa durante a incubação pode pingar sobre o ágar. A gota espalha as colônias e funde as que estavam isoladas, como explica o tutorial do JoVE. Há exceções definidas pelo método: na contagem de bolores e leveduras, o Bacteriological Analytical Manual (BAM) da FDA, no capítulo 18, manda incubar as placas sem inverter.

Tempo e temperatura dependem do microrganismo e do método. Como referência, o controle microbiológico das fichas técnicas da Sora usa 30–35 °C por 18–24 h para bactérias no ágar triptona de soja e 35–37 °C por 18–48 h no ágar nutriente e no ágar base sangue.

Erros comuns na técnica de estrias

1. Placa úmida ou recém-saída da geladeira. A água livre faz as colônias escorrerem e se fundirem. Seque e tempere a placa antes de semear.
2. Alça quente. Alça metálica recém-flambada mata as células e espirra material (chiado ao tocar o ágar). Espere esfriar ou encoste-a primeiro numa área do ágar sem inóculo.
3. Reaproveitar o inóculo. Voltar ao quadrante 1 ou pegar material de novo no meio da semeadura desfaz a diluição. Cada quadrante parte só do anterior.
4. Não esgotar. Inóculo grande demais, quadrantes sobrepostos ou estrias espaçadas fazem o último setor ficar tão denso quanto o primeiro.
5. Riscar o ágar. Pressão excessiva rasga a superfície, e o crescimento acompanha a ranhura.
6. Não inverter a placa. A condensação cai sobre as colônias.

Outros tipos de semeadura e quando usar

A semeadura por esgotamento isola, mas não conta. Para quantificar ou para outros fins há técnicas próprias:

Volumes e temperatura da tabela vêm do tutorial do JoVE, que considera estatisticamente válida, na contagem por profundidade, a faixa de 30 a 300 UFC por placa. Segundo a ISO, a semeadura em superfície da ISO 4833-2 é recomendada quando a amostra tem partículas pequenas difíceis de distinguir das colônias ou cor intensa que atrapalha a leitura na placa em profundidade.

Meios típicos para a semeadura por esgotamento

Qualquer meio sólido em placa recebe estrias. Na rotina, quatro aparecem mais:

• Ágar Triptona de Soja (TSA). Meio de uso geral, sem inibidores, para ampla variedade de microrganismos. A ficha prevê enriquecimento opcional com 5% v/v de sangue desfibrinado.
• Ágar Nutriente. Para o cultivo de microrganismos pouco exigentes; um meio simples para repique e purificação.
• Ágar MacConkey. Seletivo e diferencial, para isolar Escherichia coli e outras bactérias entéricas. Aqui a colônia isolada faz diferença, porque a reação que diferencia as colônias só se lê em colônia separada.
• Ágar Base Sangue. Com 5% v/v de sangue desfibrinado estéril, adicionado ao meio resfriado a 45–50 °C, serve ao isolamento de microrganismos exigentes, como Neisseria e estreptococos. O preparo está em como preparar ágar sangue.

A Sora emite certificado de análise para cada lote, depois do envase. O lote que o laboratório reidrata, porém, continua sendo liberado pelo próprio laboratório, com o controle de qualidade do seu método.

Veja os meios de cultivo, enriquecimento e manutenção do catálogo, com composição, preparo e controle microbiológico publicados em cada ficha técnica. Para escolher o meio do seu POP de isolamento ou revisar a técnica de semeadura do laboratório, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas