Teste de catalase: como fazer, interpretação e para que serve na identificação de bactérias

O teste de catalase verifica se a bactéria produz catalase, a enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Em contato com peróxido de hidrogênio a 3%, a cultura catalase-positiva forma bolhas imediatas; a negativa, não. É a prova rápida que separa Staphylococcus (catalase-positivo) de Streptococcus (catalase-negativo) entre os cocos gram-positivos e abre a sequência de identificação.

Uma nota sobre o termo: "teste de catalase" também aparece em buscas sobre exames de fezes, urina ou vômito na área médica e veterinária. São outros exames, fora do escopo deste guia, que trata da prova microbiológica feita a partir de colônias isoladas.

Princípio: o que a catalase faz

A catalase catalisa a reação 2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂. O oxigênio liberado aparece como efervescência visível a olho nu. A enzima protege a célula do peróxido gerado no metabolismo aeróbio; por isso a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas é catalase-positiva, enquanto as anaeróbias estritas, em geral, não produzem a enzima.

Pelo protocolo da American Society for Microbiology (ASM), o teste é essencial para diferenciar Micrococcaceae, catalase-positivas, de Streptococcaceae, catalase-negativas. Serve principalmente para separar gêneros e, em alguns casos, para ajudar na identificação de espécies de gram-positivos.

Como fazer o teste de catalase

O reagente é peróxido de hidrogênio a 3%, a concentração indicada no FDA BAM (reagente R12). Trabalhe com colônia pura e bem isolada e registre o meio de origem e o tempo de incubação.

Método em lâmina

1. Coloque uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% em lâmina de vidro limpa.
2. Com alça estéril, retire uma porção pequena do centro de uma colônia isolada, sem arrastar ágar.
3. Emulsione a colônia na gota.
4. Observe imediatamente, de preferência contra fundo escuro.

O BAM considera positivo o borbulhamento imediato. A efervescência pode projetar gotículas: siga a biossegurança que o microrganismo exige e descarte a lâmina como material contaminado.

Método em tubo

Para culturas em ágar inclinado, o BAM orienta verter 1 mL de peróxido de hidrogênio a 3% sobre o crescimento; bolhas de gás indicam teste positivo. O reagente fica contido no tubo e a reação é lida sobre uma massa maior de células.

Interpretação: teste de catalase positivo e negativo

Bolhas tardias ou poucas bolhas isoladas não equivalem a uma reação positiva franca. Na dúvida, repita com colônia nova, de meio sem sangue, e com os controles positivo e negativo lado a lado.

Para que serve: Staphylococcus x Streptococcus

O uso clássico é a triagem de cocos gram-positivos: depois do Gram, a catalase separa estafilococos e micrococos, positivos, dos estreptococos, negativos, e cada ramo segue uma bateria diferente. A catalase não diferencia Staphylococcus de Micrococcus, porque os dois são positivos, nem identifica a espécie. Ela indica o caminho.

Teste de catalase para Staphylococcus aureus

Em alimentos e laticínios, as colônias suspeitas de Staphylococcus aureus costumam vir de dois meios seletivos:

• Ágar Base Baird-Parker: a ficha descreve as colônias de estafilococos coagulase-positivos como cinza-negras, com zona límpida ao redor, que pode ficar opaca com a incubação prolongada. No controle microbiológico, S. aureus ATCC 25923 e ATCC 6538 formam colônias cinza-negras e brilhantes, com lecitinase positiva. A ficha lembra que outras bactérias podem crescer no meio e que a confirmação exige provas bioquímicas.
• Ágar Sal Manitol: o cloreto de sódio a 75 g/L inibe a maior parte das bactérias que não são estafilococos, e quem fermenta o manitol forma colônias amarelas com zona amarela. Pela ficha, S. aureus ATCC 25923 dá colônias amarelas ou brancas com zona amarela, e Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, colônias vermelhas.

A colônia típica, gram-positiva em cachos e catalase-positiva, segue para a coagulase. Veja os meios para Staphylococcus do catálogo.

Catalase e coagulase, catalase e oxidase: a sequência

Catalase e coagulase. Para estafilococos, a coagulase vem depois da catalase. Segundo a ASM, ela diferencia S. aureus de S. epidermidis e de outras espécies coagulase-negativas: no tubo, S. aureus coagula plasma tratado com EDTA; na lâmina, forma grumos. Em alimentos, a ISO 6888-1:2021 conta os estafilococos coagulase-positivos em ágar Baird-Parker, incubado em aerobiose de 34 °C a 38 °C, e confirma as colônias pela prova de coagulase.

Catalase e oxidase. A oxidase detecta a citocromo c oxidase: o reagente de tetrametil-p-fenilenodiamina passa de incolor a azul-escuro ou púrpura (azul de indofenol), segundo a ASM, que cita Neisseria gonorrhoeae como oxidase-positiva e Staphylococcus e Streptococcus como oxidase-negativos. Na prática, a catalase orienta os gram-positivos e a oxidase pesa mais nos gram-negativos, onde separa as enterobactérias, oxidase-negativas, de outros grupos.

A sequência comum de triagem é Gram → catalase (gram-positivos) ou oxidase (gram-negativos) → provas específicas do grupo. A seleção de Identificação bioquímica reúne os meios dessas provas.

Cuidados que evitam resultado falso

Colônia de ágar sangue

O BAM alerta: colônia retirada de placa de ágar sangue pode arrastar hemácias e dar falso-positivo, porque o sangue também tem atividade de catalase. Pegue só o topo da colônia, sem tocar o ágar, ou, melhor, repique antes em meio sem sangue.

O Ágar Caseína-Soja (TSA) cumpre os dois papéis: com 5% v/v de sangue desfibrinado, é a base do ágar sangue (veja como preparar ágar sangue); sem sangue, é meio de uso geral para o repique. O Ágar Nutriente também atende ao repique de microrganismos pouco exigentes.

Idade e pureza da colônia

Use colônia jovem, lida no tempo indicado na ficha do meio. As fichas da Sora leem o TSA a 30–35 °C em 18–24 h e o Ágar Nutriente a 35–37 °C em 18–48 h. Colônia mista gera leitura duvidosa: purifique antes.

Reagente e meio de origem

O peróxido perde força com o tempo; por isso o controle positivo acompanha cada frasco de reagente, conforme o POP. O meio de onde a colônia vem precisa estar liberado: a Sora emite certificado de análise por lote, mas o meio reidratado no seu laboratório é liberado por você. Veja como preparar meio de cultura desidratado e o teste de promoção de crescimento.

Controles positivo e negativo

Teste o reagente com uma cepa positiva e uma negativa conhecidas, nas mesmas condições da amostra. Um par prático:

• Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
• Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

As duas cepas constam do controle microbiológico da ficha do Ágar Nutriente da Sora, com crescimento bom a abundante a 35–37 °C em 18–48 h, então os dois controles crescem no mesmo meio sem sangue. As cepas definitivas são as do POP do laboratório ou da norma do seu método.

Meios para a colônia que vai ao teste

A Sora não fornece o reagente de catalase; fornecemos os meios de onde a colônia sai: isolamento seletivo em Baird-Parker ou sal manitol, repique em TSA ou ágar nutriente e a seleção de cultivo, enriquecimento e manutenção. Para ensino e pesquisa, veja a seleção de microbiologia clínica (pesquisa e ensino). Os produtos são para uso laboratorial profissional, sem finalidade diagnóstica in vitro. Para montar o fluxo de identificação e as cepas de controle do seu POP, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas