Ágar sangue: para que serve, como preparar a partir da base e como ler a hemólise

O ágar sangue é um meio enriquecido e não seletivo: o sangue fornece nutrientes para microrganismos exigentes, como os estreptococos, e torna visível a hemólise, que diferencia as colônias. Por isso é usado para cultivar esses microrganismos e observar o padrão de hemólise.

Para preparar ágar sangue, dissolva e esterilize a base, resfrie-a a 45–50 °C e adicione 5% v/v de sangue desfibrinado estéril, de forma asséptica. Depois, homogeneíze sem formar bolhas e distribua em placas de espessura uniforme. É o que declara a ficha técnica do Ágar Sangue Base da Sora, que usa 40 g/L e esterilização a 121 °C por 15 minutos. Quase toda hemólise mal definida, todo sangue lisado e toda placa contaminada vêm de um destes quatro pontos: temperatura, qualidade do sangue, assepsia ou espessura da placa.

A hemólise é uma característica de cultivo: orienta a identificação, mas sozinha não define a espécie.

Passo a passo do preparo

1. Dissolva e esterilize a base

Pela ficha, suspenda 40,0 g em 1000 mL de água destilada, aqueça até a ebulição para dissolver completamente e esterilize em autoclave a 121 °C (15 lb/pol²) por 15 minutos. O pH final declarado é 7,3 ± 0,2 a 25 °C, e ele é conferido na base, antes do sangue. Para pesagem, água e ciclo de autoclave, veja o guia de como preparar meio de cultura desidratado.

2. Resfrie a base a 45–50 °C e saiba por quê

Mantenha a base em banho-maria com termômetro. Não confie no tato do frasco. A USP <1117> indica a faixa de 45 a 50 °C, com o meio fundido mantido nela por no máximo 8 horas, e o FDA BAM (meio M159) resfria a base a 50 °C antes de adicionar o sangue de carneiro.

• Acima da faixa, o calor danifica as hemácias. O meio escurece para marrom e perde a opacidade. É de propósito o princípio do ágar chocolate, em que o sangue é aquecido para liberar o conteúdo das hemácias. No ágar sangue, porém, o meio pré-lisado cria halos falsos e encobre os verdadeiros.
• Abaixo da faixa, o ágar começa a gelificar. O sangue não se distribui por igual, formam-se grumos e estrias, e a superfície fica irregular.

3. Prepare e inspecione o sangue

Use sangue desfibrinado e estéril, dentro da validade do fornecedor, conservado refrigerado e nunca congelado: o congelamento rompe as hemácias. Antes de abrir o frasco:

• inverta-o suavemente, porque as hemácias sedimentam;
• confira o sobrenadante: plasma vermelho indica sangue já hemolisado;
• descarte o frasco se houver coágulos, turvação ou odor.

Sangue tirado direto da geladeira esfria a base no ponto de contato e pode gelificá-la ali. Deixe o frasco perder o frio antes de usar.

4. Adicione o sangue com assepsia

Trabalhe em cabine ou em área limpa, com pipeta estéril, e escorra o sangue pela parede do frasco. A proporção de 5% v/v corresponde a cerca de 50 mL de sangue por litro de base; o BAM M159 descreve 5 mL para cada 100 mL de ágar. Essa é a etapa crítica para a contaminação, porque o sangue entra depois da autoclave e não é mais esterilizado.

5. Homogeneíze sem bolhas e distribua

Misture com rotação lenta, sem agitar. Bolhas na superfície atrapalham a leitura e o espalhamento do inóculo, e as placas com bolhas devem sair na inspeção. Distribua um volume fixo por placa em superfície nivelada: o BAM M159 usa 20 mL por placa de 15 × 100 mm. Em placa espessa ou desigual, o halo fica difícil de enxergar e não se compara entre placas.

6. Controle de esterilidade e de desempenho

Incube uma amostra das placas de cada lote sem inóculo, nas condições de uso, para confirmar a esterilidade. A ISO 11133 trata do preparo, do armazenamento e dos ensaios de desempenho de meios preparados no laboratório. A CLSI M22-A3 (2004), hoje arquivada, se aplica a meios comprados prontos. Para placas que você prepara, o controle do lote é seu.

No desempenho, a ficha do Ágar Sangue Base declara o comportamento esperado com 5% v/v de sangue, após 35–37 °C por 18–48 horas:

Uma cepa beta-hemolítica que não forma halo claro é sinal de problema no lote, em geral no sangue ou na temperatura de adição. O procedimento de liberação está no artigo sobre o teste de promoção de crescimento em meios de cultura.

Qual sangue usar: carneiro, cavalo ou humano

O sangue de carneiro é o mais citado. Segundo a ASM, nos Estados Unidos o ágar sangue costuma ser preparado com base de ágar triptona de soja ou de ágar Columbia e 5% de sangue de carneiro. A espécie do sangue muda o resultado, e a ficha da Sora registra dois exemplos:

• algumas cepas de estreptococos do grupo D são beta-hemolíticas em ágar sangue de cavalo, de coelho e humano e alfa-hemolíticas em ágar sangue de carneiro;
• Haemophilus haemolyticus é beta-hemolítico em sangue de cavalo e de coelho e pode ser confundido com estreptococos beta-hemolíticos. O sangue de carneiro é deficiente em nucleotídeos de piridina e não permite o crescimento de H. haemolyticus, o que contorna o problema.

A ficha acrescenta que o padrão de hemólise pode variar também com o meio base. Na prática, fixe a espécie do sangue e a base no POP e registre as duas em cada lote. O sangue humano, além de alterar a hemólise, é material biológico potencialmente infectante e não é a escolha de rotina para preparar ágar sangue.

Conservação e validade

A base desidratada fica abaixo de 30 °C e as placas preparadas, entre 2 e 8 °C (ficha). A USP <1117> pede proteção contra luz e calor excessivo e placas embaladas antes de armazenamento prolongado, para retardar a perda de umidade. A validade das placas não vem pronta: o laboratório a define e a sustenta com testes de desempenho ao longo do período. Antes do uso, descarte placas escurecidas, ressecadas, com condensação excessiva ou com colônias.

Como ler a hemólise

Incube conforme o protocolo. A ficha recomenda atmosfera com CO₂ aumentado ou anaerobiose, porque a atmosfera influencia a hemólise dos estreptococos beta-hemolíticos. Leia com luz transmitida: segure a placa contra uma fonte de luz e observe por trás. A luz refletida, de cima, esconde halos estreitos.

• Beta (β): lise completa das hemácias. Ao redor da colônia, o meio perde a opacidade e fica claro e transparente. É o caso de S. aureus ATCC 25923 e S. pyogenes ATCC 19615 na ficha.
• Alfa (α): halo esverdeado ou acastanhado, sem destruição completa das hemácias. Em S. pneumoniae, o halo resulta da oxidação da hemoglobina a metemoglobina pelo peróxido de hidrogênio que a bactéria produz (McDevitt et al., 2020).
• Gama (γ) ou nenhuma: o meio continua vermelho e opaco, como com S. epidermidis ATCC 12228.

Dois cuidados de leitura. Primeiro, não confunda a sombra da colônia com o tom esverdeado. Segundo, faça também uma picada no ágar ao fim da estria: a estreptolisina O é lábil ao oxigênio, e parte da hemólise só aparece abaixo da superfície.

Erros comuns: tabela de solução de problemas

O que a ficha técnica da Sora declara

A ficha do Ágar Sangue Base traz o preparo, o pH, a cor esperada (âmbar-claro sem sangue; vermelho-cereja e opaco com sangue), o controle microbiológico com a hemólise de cada cepa e as limitações citadas acima. A ficha do Ágar Triptona de Soja (TSA) também prevê a adição de 5% v/v de sangue desfibrinado ao meio resfriado a 45–50 °C. Os dois são fornecidos desidratados: o lote de placas é preparado e liberado no seu laboratório.

Veja outros meios em Microbiologia clínica (pesquisa e ensino), em Enterococcus e estreptococos e em Neisseria e gonococos. Para padronizar o preparo de ágar sangue nas aulas práticas ou na pesquisa, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas