Coloração de Gram: passo a passo, reagentes e interpretação

A coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial que separa as bactérias em dois grupos pela estrutura da parede celular: as gram-positivas retêm o cristal violeta e ficam roxas; as gram-negativas perdem esse corante na descoloração e ficam rosa a vermelhas com o contracorante. São quatro etapas sobre um esfregaço fixado pelo calor: cristal violeta, lugol (iodo de Gram), descorante (álcool, acetona ou mistura dos dois) e safranina. O protocolo da American Society for Microbiology (ASM), de Smith e Hussey, trata a técnica como a coloração mais usada em bacteriologia e fundamental para a caracterização fenotípica das bactérias.

Em poucos minutos, o Gram informa a reação, a forma e o arranjo das células. É ele que diz se vale semear um meio seletivo para gram-negativos ou para estafilococos, e se a cultura está pura.

O que é a coloração de Gram e por que ela funciona

Parede celular e peptidoglicano

A diferença está no peptidoglicano. Segundo a ASM, nas gram-positivas ele forma camadas espessas, cerca de 90% da parede; nas gram-negativas, é uma camada fina, cerca de 10% da parede, coberta por uma membrana externa rica em lipídeos. Archaea e eucariotos não têm peptidoglicano, e a técnica não se aplica a eles.

Do complexo cristal violeta-iodo à descoloração

O mecanismo, descrito em 1983 por Davies e colaboradores e por Beveridge e Davies, tem três momentos:

1. Cristal violeta. Em solução aquosa, o corante se dissocia, e o cátion (CV⁺) atravessa a parede e a membrana de todas as células, que ficam roxas.
2. Lugol. O iodo reage com o CV⁺ e forma complexos grandes de cristal violeta-iodo (CV-I) no citoplasma e nas camadas externas.
3. Descorante. O álcool ou a acetona dissolve os lipídeos. Na gram-negativa, a membrana externa se perde, a parede fina fica permeável e o complexo CV-I sai. Na gram-positiva, o peptidoglicano espesso e muito reticulado se desidrata e aprisiona o complexo.

Depois da descoloração, só as gram-negativas estão incolores. A safranina, corante catiônico, as revela em rosa a vermelho.

Reagentes da coloração de Gram

O protocolo da ASM usa a modificação de Hucker, em que o oxalato de amônio evita a precipitação do cristal violeta. Os reagentes podem ser preparados no laboratório ou comprados prontos de fornecedores de corantes.

Sobre o descorante, a ASM informa que a acetona é a mais rápida, seguida da mistura acetona-etanol e, por último, do etanol, recomendado para iniciantes justamente por reduzir o risco de descolorir demais. Muitos laboratórios brasileiros usam fucsina como contracorante no lugar da safranina; a leitura é a mesma (gram-negativas em rosa a vermelho), mas o tempo de contracoloração deve seguir o POP validado do laboratório. A ASM recomenda reagentes recém-preparados e a filtragem dos mais antigos antes do uso.

Preparo do esfregaço

O resultado do Gram começa no esfregaço. A ASM é explícita: a espessura do esfregaço afeta o resultado, e o grupo que revisou o protocolo recomenda um esfregaço fino, sem grumos nem áreas irregulares.

1. Escolha a cultura. Use cultura jovem, em crescimento ativo. Para isolados de rotina, isso significa colônia recente em meio não seletivo, como o Ágar Caseína-Soja ou o Ágar Nutriente.
2. Emulsione pouco material. Em lâmina limpa e desengordurada, misture uma porção pequena da colônia em uma gota de água ou salina e espalhe em camada fina. De caldo, use uma alçada diretamente.
3. Seque ao ar. Não aqueça o esfregaço molhado.
4. Fixe pelo calor. Passe a lâmina seca pela chama, com o esfregaço para cima, sem superaquecer. Calor excessivo deforma as células e altera a coloração.

Em esfregaço denso demais, a ASM observa que fica difícil ver forma e arranjo das células, além de ser preciso descorar mais.

Coloração de Gram passo a passo

O passo a passo abaixo é o do protocolo da ASM (Smith e Hussey), com os tempos publicados:

1. Cristal violeta: cubra o esfregaço seco e fixado por 1 minuto.
2. Lavagem: água corrente em fluxo suave e indireto, por 2 segundos.
3. Lugol: cubra a lâmina e aguarde 1 minuto.
4. Lavagem: água em fluxo suave e indireto, por 2 segundos.
5. Descorante: cubra a lâmina por 15 segundos, ou aplique gota a gota até o líquido que escorre sair sem cor. A ASM cita 5 a 15 segundos no gotejamento e 15 segundos ou menos quando a lâmina é coberta.
6. Safranina: cubra a lâmina por 30 segundos a 1 minuto.
7. Lavagem e secagem: lave até o efluente sair sem cor e seque com papel absorvente, sem esfregar.
8. Leitura: microscópio de campo claro, aumento de 1000×, com óleo de imersão, com a luz ajustada para mostrar a cor.

A descoloração é a etapa crítica. A ASM a chama de "o passo mais crucial" da técnica, e o tempo certo depende da espessura do esfregaço.

Interpretação: gram-positivo e gram-negativo

Cor

• Gram-positivas: azul-arroxeadas a roxas.
• Gram-negativas: rosa a vermelhas.
• Gram-variáveis: mistura de células rosas e roxas na mesma cultura.

Forma e arranjo

Além da cor, registre a morfologia: cocos (isolados, aos pares, em cadeias ou em cachos), bastonetes (curtos, longos, com extremidades arredondadas ou retas), cocobacilos e formas curvas. A combinação orienta o próximo passo. Cocos gram-positivos em cachos sugerem estafilococos; cocos gram-positivos em cadeia, estreptococos; bastonetes gram-negativos de colônia não exigente, enterobactérias. O Gram não identifica a espécie: a confirmação vem de provas bioquímicas e de outros testes.

Exceções que a ASM registra

• Actinomyces, Corynebacterium, Mycobacterium e outros gêneros gram-positivos podem corar como gram-negativos ou gram-variáveis, porque a parede se rompe com facilidade na divisão celular.
• Em Bacillus e Clostridium, a espessura do peptidoglicano cai durante o crescimento, e células gram-negativas aparecem em número crescente.
• Acinetobacter spp. são cocos gram-negativos resistentes à descoloração e podem parecer gram-positivos mesmo com a técnica bem feita.
• Mycobacterium spp. têm envoltório ceroso e não coram bem pelo Gram.
• Gardnerella tem parede de estrutura gram-positiva incomum e cora como gram-negativa ou gram-variável.

Erros comuns na técnica de coloração de Gram

Controles da coloração

A ASM recomenda um controle na mesma lâmina: ao lado do esfregaço em teste, um esfregaço de células com reação de Gram conhecida. Na prática, usa-se uma cepa de referência gram-positiva, como Staphylococcus aureus, e uma gram-negativa, como Escherichia coli. Se o controle gram-positivo sair rosa ou o gram-negativo sair roxo, a lâmina inteira é invalidada, e o problema costuma estar na descoloração ou nos reagentes.

Quando a reação é duvidosa, a ASM cita o teste do KOH a 3% como confirmação: uma alçada de cultura de 18–24 h em ágar sangue, emulsionada em uma gota de KOH a 3%, forma um fio viscoso (DNA liberado) em até 60 segundos se a bactéria for gram-negativa; as gram-positivas não são afetadas. Para preparar as placas, veja como preparar ágar sangue a partir do Ágar Sangue Base.

Coloração de Gram e meios de cultura

A cultura certa para corar

O Gram só é confiável quando a cultura é jovem e a colônia é representativa. Meios de uso geral e não seletivos sustentam o crescimento sem estressar a célula e facilitam a leitura da pureza. A qualidade do próprio meio também conta: meio mal reidratado ou superaquecido tende a dar crescimento fraco. O passo a passo está em como preparar meio de cultura desidratado, e outros meios de uso geral estão na seleção de cultivo, enriquecimento e manutenção.

O Gram orienta o meio seletivo

Com a reação e a morfologia em mãos, o subcultivo seletivo fica dirigido:

• Bastonetes gram-negativos: o Ágar MacConkey tem cristal violeta e sais biliares, que, segundo a ficha técnica da Sora, inibem a maioria das bactérias gram-positivas, e a lactose diferencia fermentadoras de não fermentadoras. Veja os meios para enterobactérias.
• Cocos gram-positivos em cachos: o Ágar Sal Manitol usa cloreto de sódio a 75 g/L, que inibe a maior parte das bactérias que não os estafilococos, e vermelho de fenol para mostrar a fermentação do manitol. Em alimentos, o Ágar Base Baird-Parker, com gema de ovo e telurito, é usado para isolar e contar estafilococos coagulase-positivos. A ficha do Baird-Parker lembra que outras bactérias podem crescer e que o exame microscópico e as provas bioquímicas fazem a diferenciação, o que devolve o Gram ao fluxo. Veja os meios para Staphylococcus.

Os meios da Sora são para uso laboratorial profissional; em amostras clínicas, a linha atende a pesquisa e ensino.

Conclusão

Uma coloração de Gram confiável depende de três coisas: cultura jovem, esfregaço fino e descoloração controlada, conferida por um controle na mesma lâmina. Com a reação e a morfologia definidas, a escolha do meio seletivo deixa de ser tentativa.

Consulte a ficha técnica de cada meio no catálogo da Sora, com composição, preparo e controle microbiológico publicados. Para montar o fluxo de isolamento do seu laboratório, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas