Bolores e leveduras em alimentos: o que são, diferença e como fazer a contagem

Bolores e leveduras são fungos: os bolores crescem como filamentos multicelulares (hifas) que formam um micélio visível, e as leveduras vivem como células isoladas que se multiplicam, em geral, por brotamento. Em alimentos, os dois são indicadores de deterioração e de falhas de higiene, e alguns bolores produzem micotoxinas. A contagem de referência segue a ISO 21527: a parte 1 usa o Ágar Base DRBC para produtos com atividade de água (aw) acima de 0,95, e a parte 2 usa o Ágar Base DG18 para aw de até 0,95, ambas com incubação a 25 ± 1 °C.

O resultado sai em UFC por grama ou por mililitro, depois de cerca de 5 dias de incubação. A seguir, a diferença entre os dois grupos, por que eles importam e o método passo a passo.

O que são bolores e leveduras

Fungos são microrganismos eucariotos, com parede celular rica em quitina e glucanas, que obtêm energia decompondo matéria orgânica. Em microbiologia de alimentos, "bolores e leveduras" (ou "leveduras e bolores") é o nome de um grupo analítico, e não de um grupo taxonômico: reúne tudo o que cresce como fungo no meio e nas condições do método.

Exemplos comuns em alimentos:

• Bolores: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Rhizopus e Cladosporium.
• Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces, Candida, Debaryomyces e Rhodotorula.

Muitos deles toleram pH baixo, alta concentração de açúcar ou de sal e baixa atividade de água. Por isso aparecem justamente onde bactérias têm dificuldade: sucos, geleias, frutas secas, queijos, pães, grãos e farinhas.

Bolores e leveduras: qual a diferença?

A diferença está na forma de crescimento. O bolor é multicelular e filamentoso; a levedura é unicelular. Isso muda o aspecto da colônia e a forma de ler a placa.

Alguns fungos são dimórficos e alternam entre as duas formas conforme a temperatura ou o meio, então a separação é prática, não absoluta. Na contagem, o laboratório pode relatar bolores e leveduras juntos ou separados, conforme o método e a especificação do cliente.

Por que bolores e leveduras importam em alimentos

O motivo principal é a deterioração. Leveduras fermentam açúcares e produzem gás, álcool e sabores estranhos em sucos, refrigerantes, xaropes e laticínios; bolores formam colônias visíveis, amolecem tecidos e alteram odor e textura em pães, frutas, queijos e grãos. Uma contagem alta também sinaliza matéria-prima de baixa qualidade, falha de higiene ou recontaminação depois do processamento.

O segundo motivo são as micotoxinas. Algumas espécies de Aspergillus, Penicillium e Fusarium produzem metabólitos tóxicos, como aflatoxinas, ocratoxina A, patulina e fumonisinas. A contagem, porém, não mede toxina: um alimento pode ter contagem baixa e toxina formada antes do processamento, ou contagem alta sem toxina. A própria ISO 21527 deixa a pesquisa de micotoxinas e a identificação da flora fúngica fora do seu escopo; elas exigem métodos próprios.

Onde a legislação pede a contagem

No Brasil, os padrões microbiológicos de alimentos estão na RDC nº 724/2022 e na Instrução Normativa nº 161/2022 da Anvisa, que traz as listas de padrões por categoria e já foi alterada por instruções posteriores, como a IN nº 313/2024. Bolores e leveduras aparecem como parâmetro em algumas categorias. Consulte a versão compilada da IN no portal da Anvisa para saber se o seu produto tem limite e qual é.

Bolores e leveduras: temperatura e meio dependem da atividade de água

A temperatura de referência para a contagem em alimentos é 25 ± 1 °C, nas duas partes da ISO 21527. O que muda entre elas é o meio, escolhido pela aw do produto:

• ISO 21527-1 (aw > 0,95): carnes, laticínios (exceto leite em pó), frutas, hortaliças e massas frescas. Meio: DRBC (dicloran rosa bengala cloranfenicol).
• ISO 21527-2 (aw ≤ 0,95): frutas secas, bolos, geleias, carnes secas, peixe salgado, grãos, cereais e derivados, farinhas, nozes, especiarias e condimentos. Meio: DG18 (dicloran glicerol 18%). A parte 2 não se aplica a produtos desidratados com aw ≤ 0,60 nem aos fungos halofílicos xerofílicos do peixe seco.

No DRBC, o dicloran reduz o diâmetro das colônias de bolores invasores e a rosa bengala suprime bactérias e restringe os bolores de crescimento rápido, o que mantém as colônias separadas e contáveis. No DG18, o glicerol a 18% (p/p) baixa a aw e favorece bolores xerofílicos e leveduras osmofílicas, que no DRBC seriam subestimados. Nos dois meios da Sora, o cloranfenicol entra pelo Suplemento Seletivo de Cloranfenicol, adicionado ao meio estéril resfriado a 50 °C, e as fichas declaram composição e critérios de desempenho de acordo com a ISO 21527-1 e a ISO 21527-2, respectivamente.

Como fazer a contagem de bolores e leveduras

O método é uma contagem de colônias em superfície. As etapas abaixo resumem a lógica; o procedimento completo, com os volumes e os critérios de leitura, está no texto da norma adotada pelo laboratório.

1. Preparo da amostra e diluições

Prepare a suspensão inicial e as diluições decimais conforme a série ISO 6887, que trata do preparo de amostras por tipo de alimento. Homogeneíze bem: em bolores, cada fragmento de hifa ou grupo de esporos pode dar uma colônia, então a homogeneização influencia o resultado.

2. Semeadura em superfície

Espalhe 0,1 mL de cada diluição sobre a superfície do ágar já solidificado, com alça de Drigalski estéril, em duplicata. A semeadura em superfície expõe as células ao oxigênio e evita o choque térmico do ágar fundido; o BAM, capítulo 18, também a prefere ao plaqueamento em profundidade e indica o DRBC só em superfície.

3. Incubação

Incube as placas com a tampa para cima, em aerobiose, a 25 ± 1 °C por 5 dias. O BAM acrescenta: no escuro, sem inverter e com o mínimo de manuseio, porque mover a placa espalha esporos e gera colônias secundárias. A ficha do DRBC reforça o cuidado com a luz: a rosa bengala sofre fotodegradação e forma substâncias tóxicas aos fungos.

4. Leitura

Leia as placas no fim da incubação e, se o bolor for invasivo, faça leituras intermediárias para não perder colônias encobertas. Escolha as placas com número de colônias dentro da faixa contável definida pela norma (fichas de meio que citam a ISO 21527 indicam placas com menos de 150 colônias). Em dúvida entre colônia de levedura e de bactéria, confirme por microscopia.

5. Cálculo e expressão do resultado

Com uma única diluição contável, divida o número de colônias pelo volume semeado e multiplique pelo inverso da diluição. Exemplo: 45 colônias na diluição 10⁻², com 0,1 mL semeado, dão 45 ÷ 0,1 × 100 = 45.000, ou seja, 4,5 × 10⁴ UFC/g. Com duas diluições consecutivas contáveis, use a média ponderada e as regras de arredondamento e de resultado abaixo do limite da ISO 7218:2024, que traz os requisitos gerais para exames microbiológicos da cadeia de alimentos.

Alternativas ao DRBC e ao DG18

Fora do método de referência, outros meios têm lugar na rotina, desde que validados pelo laboratório:

• Ágar Rosa Bengala Cloranfenicol: traz o cloranfenicol já incorporado (0,10 g/L) e dispensa suplemento. A ficha o indica para isolamento seletivo e contagem de leveduras e bolores de alimentos e materiais ambientais, com pH final de 7,2 ± 0,2 e incubação de controle a 25–30 °C por 5 dias. Também deve ficar protegido da luz.
• Ágar Sabouraud Cloranfenicol: pH ácido e antibiótico; a ficha cita amostras de alimentos e de laticínios entre os tipos de amostra.

Em produtos farmacêuticos e cosméticos não estéreis, a referência muda: a USP <61> e a Ph. Eur. 2.6.12 contam bolores e leveduras (TYMC) em Ágar Sabouraud Dextrose. A escolha entre Sabouraud, Sabouraud com cloranfenicol e BDA, com os erros de preparo de meio ácido, está no guia ágar Sabouraud, Sabouraud com cloranfenicol ou batata dextrose.

Controle de qualidade do meio

Antes de usar um lote novo, verifique se o meio recupera os fungos e inibe as bactérias. O controle microbiológico declarado na ficha do DRBC da Sora, após até 5 dias a 25 ± 1 °C, mostra crescimento bom a abundante de Candida albicans ATCC 10231, S. cerevisiae ATCC 9763, Mucor racemosus ATCC 42647 e Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, e inibição de Bacillus subtilis ATCC 6633 e Escherichia coli ATCC 25922 e ATCC 8739. A Sora emite certificado de análise por lote do pó; o lote que o seu laboratório reidrata é liberado pelo seu próprio teste. O passo a passo está em teste de promoção de crescimento em meios de cultura e os cuidados de reidratação, em como preparar meio de cultura desidratado.

Qual meio usar

Para alimentos com aw acima de 0,95, use DRBC; para aw de até 0,95, DG18; nos dois casos, 25 ± 1 °C por 5 dias, com semeadura em superfície. O Rosa Bengala Cloranfenicol e o Sabouraud com cloranfenicol servem à rotina quando o método do laboratório os prevê. Para farmacêuticos, siga a farmacopeia.

Veja todos os meios para fungos e leveduras e a seleção para alimentos e laticínios, com composição, preparo e controle microbiológico publicados na ficha técnica de cada um. Para montar ou revisar o POP de contagem de bolores e leveduras, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas