Ágar Mueller Hinton e caldo Mueller Hinton: para que servem, preparo e controle de qualidade no antibiograma

O ágar Mueller Hinton é o meio de referência do teste de sensibilidade a antimicrobianos por disco-difusão, o antibiograma pelo método de Kirby-Bauer. O caldo Mueller Hinton é a mesma base sem ágar, usada nos métodos de diluição que determinam a concentração inibitória mínima (CIM). Os dois são adotados pelos documentos do CLSI e do EUCAST, este seguido no Brasil pelo BrCAST, porque a composição é simples e reprodutível e porque os fatores que alteram o resultado (profundidade, pH, cátions e timidina) podem ser controlados. Segundo as fichas técnicas da Sora, o ágar é reconstituído a 38 g/L e o caldo a 21 g/L, ambos com pH final de 7,3 ± 0,1 a 25 °C.

Este guia trata do meio. Inóculo, carga dos discos, pontos de corte e faixas de controle são definidos pelo documento de referência que o seu laboratório adota (CLSI M02 e M07 ou o método BrCAST/EUCAST), e é ele que manda.

O que é o meio Mueller Hinton

O meio foi descrito em 1941 por J. Howard Mueller e Jane Hinton para o isolamento primário do gonococo e do meningococo; por isso a ficha do ágar ainda declara o cultivo de Neisseria. Em 1966, Bauer, Kirby, Sherris e Turck publicaram o método padronizado de disco único sobre ágar Mueller Hinton, origem do "Kirby-Bauer".

Hoje, três sistemas definem o método:

• CLSI: M02 (disco-difusão, 14ª ed., 2024), M07 (diluição, 12ª ed., 2024) e as tabelas do M100 (36ª ed., 2026).
• EUCAST: manual de disco-difusão (versão 13.0, janeiro de 2025) e documento de preparo de meios (versão 8.0, janeiro de 2026).
• BrCAST (Comitê Brasileiro de Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos): publica em português o método de disco-difusão, a tabela de controle de qualidade e os pontos de corte clínicos, alinhados ao EUCAST.

Os sistemas diferem nos meios para exigentes, nas cepas de controle e nos pontos de corte. Escolha um e siga-o por inteiro: halo medido por um método e interpretado pela tabela do outro não tem validade.

Composição e função de cada ingrediente

As fichas da Sora declaram a mesma base para o ágar e o caldo:

A fórmula não tem indicadores nem agentes seletivos: o meio precisa sustentar crescimento confluente e deixar o antimicrobiano difundir sem interferência.

Por que o meio é padronizado: o que muda o halo

O diâmetro do halo depende do meio tanto quanto da bactéria. A ficha do ágar lista as variáveis que mais deslocam o resultado.

Profundidade de 4 mm

Ágar com mais de 4 mm pode dar resultado falso-resistente; com menos de 4 mm, falso-sensível. O EUCAST pede 4,0 ± 0,5 mm e cita volumes aproximados de 25 mL na placa de 90 mm, 31 mL na de 100 mm e 71 mL na de 150 mm, mas recomenda calcular pelo diâmetro real da placa. A conta está no guia como calcular meio de cultura.

pH entre 7,2 e 7,4

A ficha especifica 7,3 ± 0,1. Com pH baixo, aminoglicosídeos e macrolídeos parecem perder potência e outros antimicrobianos aparentam atividade excessiva; com pH alto, o efeito se inverte.

Cátions divalentes (cálcio e magnésio)

O teor de cálcio e magnésio afeta aminoglicosídeos, tetraciclina e colistina frente a Pseudomonas aeruginosa: cátions demais reduzem o halo; de menos, o aumentam. Nos métodos de diluição, o CLSI M07 e a ISO 20776-1:2019 usam caldo Mueller Hinton ajustado em cátions. A faixa de 20 a 25 mg/L de cálcio e 10 a 12,5 mg/L de magnésio vem do estudo de Barry e colaboradores (1992) sobre P. aeruginosa e aminoglicosídeos.

Timidina e timina

Em excesso, revertem o efeito das sulfonamidas e da trimetoprima, e os halos ficam menores ou pouco nítidos. Na abordagem do CLSI, o teor de timidina do lote é verificado com Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a um disco de sulfametoxazol-trimetoprima.

CO₂, umidade e tempo

O CO₂ altera os halos de aminoglicosídeos, macrolídeos e tetraciclinas, e a ficha orienta não incubar o ágar Mueller Hinton em CO₂ no teste dos não exigentes. Não pode haver gotículas na superfície nem na tampa, e o meio deve ser inoculado em até 15 minutos após o ajuste da suspensão.

Como preparar o ágar e o caldo Mueller Hinton

Ágar, conforme a ficha:

1. Suspenda 38 g em 1.000 mL de água purificada ou destilada.
2. Aqueça até a ebulição, até dissolver completamente.
3. Esterilize em autoclave a 121 °C por 15 minutos.
4. Resfrie a 45–50 °C, homogeneíze e distribua sobre superfície nivelada, no volume que dá 4 mm.
5. Depois de solidificado, confira o pH e deixe a superfície sem umidade visível antes de usar.

O frasco de 500 g rende 13,157 L, cerca de 526 placas de 90 mm a 25 mL. O pó é conservado abaixo de 30 °C e as placas, entre 2 e 8 °C.

Caldo: suspenda 21 g em 1.000 mL de água destilada, ferva para dissolver (a fervura antes da autoclave evita que o amido sedimente), esterilize a 121 °C por 15 minutos e homogeneíze antes de distribuir. A ficha pede meio recém-preparado. O frasco de 500 g rende 23,8 L.

Os erros gerais de pesagem, dissolução e superaquecimento estão no guia como preparar meio de cultura desidratado.

Disco-difusão (Kirby-Bauer) no ágar Mueller Hinton

O teste parte de cultura pura, como a ficha exige; colônias isoladas por semeadura por esgotamento evitam halos com crescimento misto. A suspensão é ajustada ao padrão 0,5 de McFarland, que o EUCAST relaciona a cerca de 1–2 × 10⁸ UFC/mL para Escherichia coli.

O EUCAST resume os tempos na regra 15-15-15: usar a suspensão em até 15 minutos, aplicar os discos em até 15 minutos após a semeadura e incubar em até 15 minutos após aplicar os discos. Enterobactérias e Pseudomonas spp. são incubadas a 35 ± 1 °C por 18 ± 2 h, em ar. No Mueller Hinton sem sangue, a leitura é feita pelo fundo da placa, sobre fundo escuro e com luz refletida, e o halo é interpretado pela tabela de pontos de corte do mesmo sistema.

A ficha registra outro limite: a disco-difusão serve a microrganismos de crescimento rápido. Incubações longas podem inativar o antimicrobiano.

Caldo Mueller Hinton e determinação da CIM

Na diluição em caldo, o antimicrobiano é diluído em série no meio e a CIM é a menor concentração sem crescimento visível. O CLSI M07 descreve a macrodiluição, a microdiluição em caldo e a diluição em ágar; a ISO 20776-1:2019 define a microdiluição em caldo como método de referência para bactérias aeróbias de crescimento rápido, e o EUCAST a segue.

A ficha do caldo da Sora declara uso na sensibilidade às sulfonamidas por diluição em tubo e no isolamento primário de gonococos e meningococos. Ela não declara ajuste de cátions: para a microdiluição de referência, suplemente cálcio e magnésio conforme o documento adotado e confirme o lote com as cepas de controle antes de liberar.

Mueller Hinton com sangue e meios para exigentes

Estreptococos, Haemophilus e Neisseria não crescem bem no Mueller Hinton puro, e aqui os sistemas divergem:

• EUCAST/BrCAST: usa o MH-F, ágar Mueller Hinton com 5% de sangue de cavalo desfibrinado mecanicamente e 20 mg/L de β-NAD, incubado em 4–6% de CO₂. O EUCAST passou a aceitar placas com sangue de carneiro (MH-S) no lugar do de cavalo, exceto para Haemophilus spp.
• CLSI: usa Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro para estreptococos e Neisseria meningitidis, o Haemophilus Test Medium (HTM) para Haemophilus influenzae e a base de ágar GC com suplemento de crescimento definido para Neisseria gonorrhoeae.

O sangue interfere no resultado. A ficha da Sora alerta que os halos de oxacilina e meticilina podem ficar 2 a 3 mm menores que no ágar sem sangue, que o sangue de carneiro pode aumentar muito os halos de algumas cefalosporinas frente a enterococos e que pode deixar halos pouco nítidos com sulfonamidas e trimetoprima.

O ágar Mueller Hinton da Sora serve de base para a placa com sangue; a técnica de adição está no guia como preparar ágar sangue, e a base GC e o ágar chocolate, no guia ágar sangue e ágar chocolate. Para H. influenzae, o catálogo tem o Ágar Base HTM para Haemophilus, usado com o Suplemento de Crescimento para Haemophilus.

Controle de qualidade com cepas de referência

A ficha do ágar declara crescimento abundante após 18–24 h a 36–37 °C de E. coli ATCC 25922 e ATCC 35218, P. aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e ATCC 43300 e E. faecalis ATCC 29212. A do caldo declara crescimento abundante de E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, E. faecalis ATCC 19433 e Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. A Sora emite certificado de análise por lote, depois do envase.

Crescer bem, porém, não prova que o halo está certo. O controle do antibiograma é feito com discos sobre as cepas de controle, comparando halos (ou CIMs) com as faixas da tabela vigente do seu sistema: o CLSI M100, as tabelas de CQ do EUCAST (versão 16.0, de 2026) ou a tabela de CQ de rotina e estendido do BrCAST. As cepas mudam entre sistemas: o CLSI usa S. aureus ATCC 25923 na disco-difusão e ATCC 29213 na CIM; o EUCAST usa ATCC 29213 nos dois. A placa que você prepara é um lote novo, liberado pelo seu laboratório com os critérios do guia do teste de promoção de crescimento somados ao controle com discos.

A ficha do ágar declara padronização conforme o documento M06 do CLSI. Esse protocolo de avaliação de lotes de Mueller Hinton desidratado foi incorporado à ISO/TS 16782:2016, que define critérios de aceitação de lotes de ágar e caldo Mueller Hinton para teste de sensibilidade.

Erros comuns no antibiograma

Próximo passo

Se a sua rotina inclui antibiograma por disco-difusão ou CIM, consulte a ficha técnica do ágar Mueller Hinton e do caldo Mueller Hinton, com composição, preparo, limitações e cepas de controle publicados, ou veja a seleção de meios para antibiograma e sensibilidade. Para dúvidas sobre preparo, suplementação ou meios para exigentes, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas