Ágar sangue e ágar chocolate: diferença, preparo e para que serve cada um

O ágar chocolate é um ágar sangue cujo sangue foi aquecido: as hemácias se rompem e liberam no meio a hemina (fator X) e o NAD (fator V), de que precisam bactérias exigentes como Haemophilus influenzae e Neisseria spp. Não leva chocolate: o nome vem da cor marrom que o sangue lisado dá ao meio. O ágar sangue, com as hemácias intactas, serve para cultivar exigentes e ler a hemólise; o ágar chocolate serve para cultivar os que não crescem bem no ágar sangue, e nele não se lê hemólise.

Os dois partem da mesma lógica: uma base nutritiva esterilizada, resfriada, que recebe sangue desfibrinado estéril. O que muda é o que se faz com o sangue depois. O preparo do ágar sangue, a temperatura de adição e a leitura de hemólise estão no guia ágar sangue: para que serve, como preparar e como ler a hemólise. Aqui o foco é o ágar chocolate.

Ágar chocolate: é feito de que e por que o sangue é aquecido

Composição do ágar chocolate

O ágar chocolate tem três componentes:

1. Base nutritiva: em geral, base Columbia ou base GC, com peptonas, amido e cloreto de sódio (a base GC acrescenta fosfatos como tampão).
2. Sangue desfibrinado aquecido, ou uma solução estéril de hemoglobina, que fornece a hemina.
3. Suplemento de enriquecimento, opcional e muito usado: NAD, vitaminas, aminoácidos, coenzimas e íons férricos, que reforçam o crescimento de Haemophilus e de Neisseria patogênicas. É o chamado ágar chocolate suplementado.

O papel do fator X e do fator V

H. influenzae precisa de hemina (fator X) e de NAD (fator V) para crescer (Musher, 1996). No ágar sangue, a hemina fica presa dentro das hemácias; o aquecimento rompe as células e a torna disponível. É por isso que H. influenzae cresce no ágar chocolate e não no ágar sangue, onde pode aparecer só como colônias satélites em volta de Staphylococcus aureus, cujo crescimento disponibiliza os fatores ao redor da colônia.

Há um segundo motivo para preferir o chocolate ao ágar sangue de carneiro. A ficha do Ágar Columbia Base registra que o sangue de carneiro é deficiente em nucleotídeos de piridina, o grupo do NAD, e não sustenta o crescimento de Haemophilus haemolyticus. A ficha do Ágar Base GC descreve a divisão de papéis: a hemoglobina fornece a hemina, e o suplemento fornece o NAD e os demais fatores.

Ágar chocolate: para que serve

O ágar chocolate é o meio de cultivo geral para bactérias exigentes, sobretudo:

• Haemophilus influenzae e outras espécies do gênero que dependem dos fatores X e V;
• Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, que crescem melhor com hemina e enriquecimento;
• Streptococcus pneumoniae e outros exigentes, que também crescem nele.

Em microbiologia clínica, ele é semeado ao lado do ágar sangue: o ágar sangue mostra a hemólise, e o chocolate recupera o que o ágar sangue não sustenta. Em subcultivo, é o meio de destino de amostras transportadas: a ficha do Meio de Transporte de Stuart (sem azul de metileno) controla a viabilidade de H. influenzae e N. gonorrhoeae por subcultivo em ágar chocolate incubado em atmosfera de CO₂.

O ágar chocolate é seletivo? É diferencial?

Não é seletivo: não contém agente inibidor, e a flora acompanhante cresce junto. Não é diferencial no sentido usual: como as hemácias já estão lisadas, não há hemólise para ler, e o meio não traz indicador. Para isolar gonococos de amostras com flora mista, usa-se a versão seletiva, o Thayer-Martin, descrito abaixo.

Como preparar ágar chocolate a partir da base

O catálogo da Sora traz as bases desidratadas, e o laboratório prepara o ágar chocolate a partir delas. Duas fichas da Sora descrevem o procedimento, com uma diferença na proporção de sangue.

Na base Columbia

Pela ficha do Ágar Columbia Base, que declara uso como base para ágar sangue e ágar chocolate:

1. Suspenda 44 g em 1000 mL de água destilada e ferva para dissolver completamente.
2. Esterilize em autoclave a 121 °C (15 lb/pol²) por 15 minutos. O pH final declarado é 7,3 ± 0,2 a 25 °C.
3. Resfrie a base a 45–50 °C.
4. Adicione 10% v/v de sangue de carneiro desfibrinado estéril.
5. Aqueça a 80 °C por 10 minutos, sob agitação constante.

A ficha manda resfriar a base a 45–50 °C antes de adicionar compostos termossensíveis. Por isso, se for usar suplemento de enriquecimento, espere o meio aquecido voltar a essa faixa antes de adicioná-lo e de distribuir nas placas.

Na base GC

A ficha do Ágar Base GC traz dois caminhos:

• Com sangue: prepare a base em concentração simples, 3,6 g em 100 mL de água destilada, esterilize a 121 °C por 15 minutos, acrescente 5% v/v de sangue desfibrinado, homogeneíze e aqueça a 80 °C por 10 minutos.
• Com hemoglobina: prepare a base em concentração dupla (7,2 g em 100 mL), esterilize, resfrie a 45–50 °C e adicione assepticamente 100 mL de solução estéril de hemoglobina a 2%, preparada à parte, e os suplementos previstos na ficha. O meio fica marrom-chocolate e opaco; o pH final declarado é 7,2 ± 0,2.

Se o laboratório usa as duas bases, padronize no POP a proporção de sangue de cada uma e registre-a em cada lote. As etapas gerais de pesagem, dissolução e autoclave estão em como preparar meio de cultura desidratado.

Cuidados que valem para as duas bases

• Aqueça com agitação e termômetro. Aquecimento desigual deixa estrias vermelhas de sangue não lisado.
• Trabalhe com assepsia. O sangue, a hemoglobina e o suplemento entram depois da autoclave e não são mais esterilizados.
• Distribua volume fixo por placa, sem bolhas.
• Incube placas sem inóculo de cada lote para confirmar a esterilidade.

Thayer-Martin: o ágar chocolate seletivo para gonococos

O Thayer-Martin é um ágar chocolate com antimicrobianos. A versão com vancomicina, colistimetato e nistatina (VCN) foi publicada por Thayer e Martin em 1966; a variante VCNT acrescenta trimetoprima. Pela ficha do Ágar Base Thayer-Martin:

• reconstituição de 42 g/L e pH final de 7,0 ± 0,2; suspenda 21,0 g em 450 mL de água destilada, ferva, esterilize a 121 °C por 15 minutos e resfrie a 45 °C;
• adicione assepticamente 50 mL de sangue lisado estéril, um frasco de suplemento de enriquecimento com fatores de crescimento e um frasco de suplemento VCN ou VCNT; homogeneíze antes de distribuir;
• como alternativa ao sangue, suspenda os 21,0 g em 250 mL e misture com 250 mL de solução de hemoglobina a 2%, as duas esterilizadas separadamente e resfriadas a 45 °C.

A vancomicina inibe gram-positivas, a colistina inibe gram-negativas e a nistatina inibe fungos. A ficha registra que o meio pode inibir espécies de Haemophilus: para esse gênero, use o ágar chocolate sem antibióticos. A ficha do Ágar Base GC lembra que antibióticos inativados ou deteriorados deixam passar contaminantes.

Ágar sangue x ágar chocolate: tabela comparativa

Incubação e leitura

A ficha do Ágar Base GC controla o meio em 5–10% de CO₂ e 70% de umidade, a 35–37 °C por 40–48 horas, e a do Thayer-Martin, a 35–37 °C por 18–48 horas. Como não há hemólise, a leitura se apoia na morfologia da colônia e em testes complementares. A ficha do Thayer-Martin descreve N. meningitidis ATCC 13090 com colônias médias a grandes, cinza-azuladas e mucoides, e N. gonorrhoeae ATCC 19424 com colônias pequenas, branco-acinzentadas a incolores. A colônia orienta, mas não identifica: as fichas recomendam testes bioquímicos e, quando indicado, imunológicos com cultura pura. Para provar a dependência de fatores em Haemophilus, usa-se a prova dos fatores X e V. Para testes de sensibilidade em Haemophilus, há o Ágar Base HTM para Haemophilus, com o Suplemento de Crescimento para Haemophilus (NAD e hematina).

Controle de qualidade e conservação

O controle microbiológico que a ficha do Ágar Columbia Base declara foi feito com 5% de sangue, isto é, como ágar sangue. Para o ágar chocolate, a referência mais próxima é a ficha do Ágar Base GC, que, com hemoglobina a 2% e suplemento, declara crescimento bom a abundante de H. influenzae ATCC 19418, N. meningitidis ATCC 13090, N. gonorrhoeae ATCC 19424, S. pneumoniae ATCC 6303 e Streptococcus pyogenes ATCC 19615. No Thayer-Martin, Escherichia coli ATCC 25922 e Proteus mirabilis ATCC 25933 devem ser inibidos.

As placas que você prepara são liberadas pelo seu laboratório. A Sora emite certificado de análise por lote do meio desidratado, mas o ensaio de desempenho do ágar chocolate pronto é seu; a ISO 11133 trata desse controle, e o procedimento está no guia de teste de promoção de crescimento em meios de cultura.

Pelas fichas, o meio desidratado fica abaixo de 30 °C e o meio preparado, entre 2 e 8 °C. A USP <1117> pede placas embaladas antes de armazenamento prolongado, para retardar a perda de umidade. A validade das placas é definida pelo laboratório, com ensaios de desempenho ao longo do período.

Qual meio usar

Para ler hemólise, use ágar sangue. Para cultivar Haemophilus e Neisseria, use ágar chocolate, preparado na base Columbia ou na base GC e, de preferência, suplementado. Para isolar gonococos de amostra com flora mista, use Thayer-Martin.

Veja os meios para Haemophilus, para Neisseria e gonococos e a linha de microbiologia clínica (pesquisa e ensino), que não se destina a diagnóstico in vitro. Para padronizar o preparo de ágar chocolate nas aulas práticas ou na pesquisa, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas