Ágar Sabouraud, Sabouraud com cloranfenicol ou batata dextrose: qual usar para fungos e leveduras

Para contar bolores e leveduras em produto farmacêutico ou cosmético não estéril, o meio de referência é o ágar Sabouraud dextrose, previsto na USP <61> e na Ph. Eur. 2.6.12 e incubado a 20–25 °C por 5 a 7 dias. Quando bactérias crescem junto e inflam a contagem, o texto harmonizado admite o Sabouraud com antibióticos, e o Sabouraud com cloranfenicol é a versão pronta. Em alimentos, os métodos de referência usam outros meios: a ISO 21527-1 emprega o DRBC para produtos com atividade de água (aw) acima de 0,95, a ISO 21527-2 emprega o DG18 para aw de até 0,95, e o FDA BAM, capítulo 18, segue a mesma linha. O ágar batata dextrose (BDA) serve sobretudo para isolar e repicar colônias e, acidificado, para trabalhos específicos.

A escolha depende de três perguntas: que método o seu dossiê adota, quanto de bactéria a amostra traz e se o objetivo é contar ou isolar.

Composição e princípio de cada meio

Ágar Sabouraud dextrose: pH ácido e muita glicose

A formulação clássica combina peptona, uma concentração alta de dextrose e pH ácido. No Ágar Sabouraud Dextrose da Sora, a ficha técnica declara peptona micológica 10 g/L, dextrose 40 g/L e ágar 15 g/L, reconstituição de 65 g/L e pH final de 5,6 ± 0,2. A glicose em excesso e o pH baixo favorecem os fungos e desfavorecem as bactérias.

Desfavorecer não é inibir. A mesma ficha declara crescimento abundante, com recuperação ≥ 70%, de Escherichia coli (ATCC 25922, ATCC 8739 e NCTC 9002) e de Lactobacillus casei ATCC 9595 após 48–72 h a 30–35 °C, ao lado de Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 e Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763. Na prática: em amostra com carga bacteriana relevante, o Sabouraud sem antibiótico vai mostrar bactéria.

Sabouraud com cloranfenicol: seletividade por antibiótico

O Ágar Sabouraud Cloranfenicol mantém a lógica do Sabouraud (dextrose 40 g/L, pH 5,6 ± 0,2) e acrescenta cloranfenicol a 0,05 g/L, que inibe ampla faixa de bactérias gram-positivas e gram-negativas. O antibiótico já vem no pó e é autoclavado com o meio, a 121 °C por 15 minutos, conforme o preparo da ficha. Isso é coerente com o BAM, que prefere o cloranfenicol justamente por ele resistir à autoclavagem.

O controle microbiológico declarado mostra o efeito: E. coli (três cepas) e L. casei ATCC 334 inibidos; A. brasiliensis, C. albicans, S. cerevisiae e Trichophyton rubrum ATCC 28191 com crescimento bom a abundante, a 25–30 °C por 48–72 h. A ficha também registra a limitação: antimicrobianos que inibem bactérias podem inibir certos fungos.

Ágar batata dextrose (BDA) e a acidificação com ácido tartárico

O BDA é um meio nutritivo simples, sem agente seletivo. O Ágar Batata Dextrose traz infusão de batata (a partir de 200 g), dextrose 20 g/L e ágar 15 g/L, com reconstituição de 39 g/L e pH 5,6 ± 0,2. A ficha declara crescimento abundante de A. brasiliensis, C. albicans e S. cerevisiae a 22–25 °C em 2–4 dias, com formação de ascósporos positiva para S. cerevisiae, e lembra que o meio não é diferencial: a identificação exige microscopia e testes complementares.

Quando o trabalho exige pH 3,5, a ficha orienta acidificar o meio já estéril e resfriado com solução estéril de ácido tartárico a 10%, cerca de 1 mL por 100 mL de meio, e não aquecer depois: o calor em pH tão baixo hidrolisa o ágar e o meio deixa de solidificar.

DRBC e DG18: os meios dos métodos de alimentos

O Ágar Base DRBC combina dicloran, que reduz o diâmetro das colônias de bolores invasores, rosa bengala, que suprime bactérias e restringe bolores de crescimento rápido, e cloranfenicol, adicionado pelo Suplemento Seletivo de Cloranfenicol. O Ágar Base DG18 usa glicerol a 18% (p/p) para baixar a aw e favorecer bolores xerofílicos. As fichas declaram composição e critérios de desempenho de acordo com a ISO 21527-1 (DRBC) e a ISO 21527-2 (DG18). A Sora tem ainda o Ágar Rosa Bengala Cloranfenicol, com o antibiótico já incorporado (0,10 g/L).

Quando usar cada um

Farmacêutico e cosmético: USP <61>/<62> e Ph. Eur. 2.6.12/2.6.13

No ensaio de enumeração microbiana, a contagem total de bolores e leveduras (TYMC) é feita em ágar Sabouraud dextrose a 20–25 °C por 5 a 7 dias. O texto harmonizado define que a TYMC é o número de UFC nesse meio e que colônias de bactéria que aparecerem nele entram na TYMC. Por isso ele admite o Sabouraud com antibióticos: é a saída quando a flora bacteriana do produto empurra a contagem para fora da especificação.

Pontos do capítulo que afetam a escolha do meio:

• Promoção de crescimento: C. albicans ATCC 10231 e A. brasiliensis ATCC 16404, no máximo 100 UFC, a 20–25 °C por até 5 dias, com recuperação que não difira por fator maior que 2 do controle.
• Leitura: a placa contada para TYMC é a que tem o maior número de colônias abaixo de 50.
• Pesquisa de C. albicans (USP <62>, Ph. Eur. 2.6.13): enriquecimento em caldo Sabouraud dextrose a 30–35 °C por 3 a 5 dias e subcultivo em ágar Sabouraud dextrose a 30–35 °C por 24–48 h. A Sora oferece o Caldo Sabouraud Dextrose.

Se o laboratório trocar o Sabouraud pelo Sabouraud com cloranfenicol, a promoção de crescimento e a adequação do método precisam ser feitas com o meio novo. O passo a passo está no artigo sobre o teste de promoção de crescimento em meios de cultura. Veja também as seleções para farmacêutico e esterilidade e para a indústria cosmética.

Alimentos: ISO 21527 e FDA BAM

Para alimentos e rações, a ISO 21527 divide o método pela atividade de água: a parte 1 cobre produtos com aw > 0,95 e a parte 2, produtos com aw ≤ 0,95, ambas com incubação a 25 ± 1 °C. O Sabouraud não é o meio desses métodos.

O BAM, capítulo 18, traz orientações práticas que valem para qualquer contagem de fungos:

• o espalhamento em superfície é considerado melhor que o plaqueamento em profundidade, e o DRBC deve ser usado só em superfície;
• o DG18 é o preferido quando a aw da amostra é menor que 0,95;
• placas incubadas no escuro, a 25 °C, sem inverter e em pilhas de no máximo 3;
• contagem após 5 dias; sem crescimento, reincubar por mais 48 h; não manusear antes, porque o manuseio gera colônias secundárias;
• com supercrescimento bacteriano, o BAM divide o antibiótico: 50 mg/L de cloranfenicol antes da autoclavagem e 50 mg/L de clortetraciclina esterilizada por filtração no meio já temperado, logo antes de verter.

BDA: isolamento e repique

O BAM indica isolar colônias em BDA ou ágar malte quando é preciso analisar e identificar a espécie. É esse o papel mais seguro do BDA na rotina: meio nutritivo para repique, purificação e observação da colônia, e não meio seletivo de contagem. A versão acidificada fica para os trabalhos específicos que a pedem.

Tabela comparativa

Erros comuns no preparo e no uso

1. Superaquecer meio ácido. As fichas do Sabouraud alertam que superaquecer um meio de pH ácido frequentemente produz meio mole. Respeite o ciclo de 121 °C por 15 minutos e não deixe o meio na autoclave nem refunda várias vezes. Os outros erros de preparo estão em como preparar meio de cultura desidratado.
2. Aquecer o BDA depois de acidificar. O ácido tartárico entra no meio estéril e resfriado; qualquer aquecimento posterior hidrolisa o ágar.
3. Adicionar o suplemento com o meio quente. No DRBC e no DG18, a ficha manda resfriar a 50 °C antes de adicionar o cloranfenicol reconstituído. Antibióticos sensíveis ao calor, como a clortetraciclina do BAM, só entram no meio temperado.
4. Tratar Sabouraud como meio seletivo. Sem antibiótico, bactérias crescem, e na farmacopeia elas contam como TYMC.
5. Expor o DRBC à luz. A ficha avisa que a rosa bengala sofre fotodegradação e forma substâncias tóxicas aos fungos.
6. Esquecer que o antibiótico também pode inibir fungos. Qualifique o meio seletivo com as cepas do seu método antes de adotá-lo.

Qual escolher

Se o método é farmacopeico, comece pelo ágar Sabouraud dextrose e passe ao Sabouraud com cloranfenicol quando a flora bacteriana do produto interferir, requalificando o meio. Se a amostra é alimento, siga a ISO 21527 com DRBC ou DG18, conforme a aw. Para isolar, repicar e identificar, use o BDA.

Veja todos os meios para fungos e leveduras do catálogo, com composição, pH, preparo e controle microbiológico publicados na ficha técnica de cada um. Para definir o meio do seu método ou revisar o POP de contagem, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas