Diluição seriada e contagem de colônias: passo a passo e cálculo de UFC

Diluição seriada é a redução da concentração da amostra em etapas fixas, em geral de 10 em 10 vezes (1 mL em 9 mL de diluente), até que uma das diluições, semeada em placa, dê um número de colônias que se possa contar com confiança. Com essa contagem, o resultado é calculado em unidades formadoras de colônia (UFC) por grama ou por mililitro: na ISO 7218, pela média ponderada de duas diluições sucessivas, N = ΣC / (V × 1,1 × d).

Este guia mostra o passo a passo, a faixa contável que cada referência adota, a fórmula com exemplos resolvidos e os erros que mais distorcem a contagem de colônias.

O que é UFC em microbiologia

UFC é a unidade da contagem em placa. Cada colônia nasce de uma célula isolada ou de um agrupamento de células (cadeias, cachos, células presas a partículas da amostra), e a placa não distingue uma coisa da outra. Por isso o resultado não se expressa em "bactérias por grama", e sim em UFC/g (sólidos) ou UFC/mL (líquidos).

Duas consequências práticas:

• a contagem em placa tende a subestimar o número real de células, e o quanto subestima depende do microrganismo e da homogeneização;
• o resultado só vale para os microrganismos que crescem naquele meio, naquela temperatura e naquele tempo. A ficha do Ágar Padrão para Contagem (PCA) registra essa limitação: como as exigências nutricionais variam, há cepas que não crescem ou crescem pouco no meio.

Diluição seriada passo a passo

1. Prepare a suspensão inicial (10⁻¹)

Em alimentos, a regra geral está na ISO 6887-1:2017: uma porção pesada da amostra é homogeneizada em nove vezes o seu volume de diluente (por exemplo, 10 g em 90 mL), o que dá a diluição 10⁻¹. Para amostras líquidas, a própria amostra é o ponto de partida (10⁰). As partes seguintes da ISO 6887 trazem as regras específicas por tipo de produto.

2. Escolha o diluente

O diluente deve manter as células vivas sem deixá-las multiplicar durante a análise. A Água Peptonada Tamponada da Sora tem composição e critérios de desempenho declarados na ficha conforme a ISO 6887-1:2017, além das normas de pré-enriquecimento de Salmonella (ISO 6579-1:2017). A ficha declara digesto enzimático de caseína 10 g/L, cloreto de sódio 5 g/L e tampão fosfato, reconstituição de 20,07 g/L, pH 7,0 ± 0,2 e esterilização a 121 °C por 15 minutos.

A Água Peptonada 1% é outro produto: a ficha a declara como meio de crescimento de uso geral e base de fermentação de carboidratos, e não como diluente de contagem. Se o seu método prevê um diluente específico, como solução salina peptonada, use o que o método pede.

3. Faça as diluições decimais

1. Identifique os tubos com 9 mL de diluente estéril: 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴...
2. Homogeneíze a suspensão anterior antes de cada transferência.
3. Transfira 1 mL para o tubo seguinte com pipeta ou ponteira estéril, sem encostar a ponta no diluente do tubo de destino.
4. Troque a pipeta ou a ponteira a cada diluição. Reaproveitar carrega células aderidas e infla as diluições mais altas.
5. Faça diluições suficientes para que ao menos uma caia na faixa contável. Sem histórico da amostra, semeie três ou quatro diluições sucessivas.

A ISO 6887-1 fixa também um prazo entre o preparo da suspensão e a semeadura. Siga o prazo da norma do seu método: diluições que esperam na bancada mudam de contagem.

Semeadura em profundidade ou em superfície

Em profundidade (pour plate): 1 mL

Na técnica da ISO 4833-1:2013 (contagem a 30 °C), 1 mL de cada diluição vai para a placa vazia e o ágar fundido e resfriado é vertido por cima e misturado. No PCA da Sora, a ficha declara triptona 5 g/L, extrato de levedura 2,5 g/L, dextrose 1 g/L e ágar 15 g/L, reconstituição de 23,5 g/L, pH 7,0 ± 0,2, esterilização a 121 °C por 15 minutos e resfriamento a 45–50 °C antes de distribuir. Ágar mais quente que isso mata parte das células e baixa a contagem.

A ISO 4833-1 indica a técnica em profundidade quando se precisa de limite de detecção baixo e para produtos com colônias espalhadas que encobririam as outras, como leite e derivados com Bacillus spp.

Em superfície (spread plate): 0,1 mL

Na técnica de superfície, descrita na ISO 4833-2:2013, um volume menor, tipicamente 0,1 mL, é espalhado sobre o ágar já solidificado e seco. As colônias ficam todas na superfície, o que facilita a leitura morfológica, mas o volume dez vezes menor eleva o limite de detecção. Para a mesma amostra, as duas técnicas podem dar resultados diferentes, e a própria ISO 4833-1 registra isso.

Antes de usar um lote novo de meio, confirme que ele recupera o que deve. O passo a passo está no guia sobre teste de promoção de crescimento em meios de cultura; os erros de reidratação estão em como preparar meio de cultura desidratado.

Quantas colônias contar: a faixa contável de cada referência

A faixa contável não é universal. Cada referência adota a sua, e o POP deve seguir a do método.

Acima do limite superior, as colônias competem por espaço e nutriente e se fundem; abaixo do inferior, o erro estatístico de uma placa com poucas colônias fica grande demais.

Diluição seriada: cálculo e fórmula da UFC

A média ponderada da ISO 7218

Quando duas diluições sucessivas têm placas contáveis, a ISO 7218 usa a média ponderada das duas:

N = ΣC / [V × (n₁ + 0,1 × n₂) × d]

• N: UFC por grama ou por mililitro;
• ΣC: soma das colônias de todas as placas retidas das duas diluições;
• V: volume semeado por placa, em mL (1 mL em profundidade; 0,1 mL em superfície);
• n₁ e n₂: número de placas retidas na primeira e na segunda diluição;
• d: a diluição da primeira (a menos diluída) das duas retidas.

Com uma placa por diluição, n₁ = n₂ = 1, e a fórmula fica N = ΣC / (V × 1,1 × d). O fator 0,1 dá à diluição mais alta o peso que ela tem: ela contém dez vezes menos amostra.

Exemplo 1: profundidade, uma placa por diluição

Amostra de alimento, 1 mL semeado por placa:

N = (168 + 15) / (1 × 1,1 × 10⁻²) = 183 / 0,011 = 16 636 UFC/g

Arredondado a dois algarismos significativos: 1,7 × 10⁴ UFC/g.

Exemplo 2: profundidade, duas placas por diluição

10⁻²: 168 e 180 colônias; 10⁻³: 15 e 21 colônias. ΣC = 384; n₁ = 2; n₂ = 2.

N = 384 / [1 × (2 + 0,2) × 10⁻²] = 384 / 0,022 = 17 455 UFC/g → 1,7 × 10⁴ UFC/g

Exemplo 3: superfície, uma placa por diluição

0,1 mL semeado; 10⁻³: 112 colônias; 10⁻⁴: 13 colônias. ΣC = 125.

N = 125 / (0,1 × 1,1 × 10⁻³) = 125 / 0,00011 = 1 136 364 UFC/g → 1,1 × 10⁶ UFC/g

Repare que o volume de 0,1 mL entra no denominador: esquecer o V é o erro de cálculo mais comum, e ele derruba o resultado em dez vezes.

E a média simples?

Métodos que não seguem a ISO 7218 calculam de outro jeito. Na regra clássica de uma diluição, multiplica-se a média das placas contáveis pelo inverso da diluição e divide-se pelo volume: 150 colônias em 1 mL de 10⁻³ dão 1,5 × 10⁵ UFC/mL. O FDA BAM tem regras próprias para combinar diluições. Não misture regras de métodos diferentes no mesmo POP.

Contagem de colônias: como expressar o resultado

• Unidade: UFC/g para sólidos, UFC/mL para líquidos, ou por unidade de área em amostras de superfície, conforme o método.
• Arredondamento: dois algarismos significativos, em notação de potência de dez (1,7 × 10⁴, e não 16 636).
• Nenhuma colônia na diluição mais baixa: o resultado é "menor que 1/d" por grama ou mililitro, ajustado pelo volume. Com 1 mL da suspensão 10⁻¹ sem colônias: < 10 UFC/g. Em superfície, com 0,1 mL: < 100 UFC/g.
• Abaixo da faixa: contagens baixas são relatadas como estimadas, e a ISO 7218 tem regras específicas para esses casos.
• Acima da faixa em todas as placas: a amostra precisava de mais diluições. O resultado, quando relatado, é uma estimativa, sinalizada como tal; o correto é repetir a análise com a série estendida.

Erros comuns na diluição seriada e na contagem

1. Pipetagem imprecisa. Cada etapa multiplica o erro da anterior. Use pipetas calibradas e volume correto em cada tubo de diluente; tubos com 9 mL que perderam volume na autoclave mudam o fator de diluição.
2. Reaproveitar a ponteira. Células aderidas passam para a diluição seguinte e inflam as contagens altas.
3. Homogeneização insuficiente. Células sedimentam e agregados não se desfazem. Homogeneíze antes de cada transferência e antes de semear.
4. Ágar quente demais. Acima de 45–50 °C, faixa da ficha do PCA, o choque térmico reduz a recuperação.
5. Colônias espalhadas (spreaders). Água condensada na tampa ou na superfície do ágar e Bacillus móveis formam véus que encobrem outras colônias. Seque as placas de superfície, incube invertidas as de profundidade e registre a placa como não contável quando o espalhamento passar do que o método admite.
6. Diluições inconsistentes. Se 10⁻² dá 168 e 10⁻³ dá 90, algo deu errado (pipetagem, arraste de células, inibição na diluição baixa). A ISO 14461-2 traz critérios para julgar a coerência entre diluições sucessivas.
7. Sem branco. Uma placa com diluente e meio sem amostra mostra se a contaminação veio do material.

Monte a sua rotina de contagem

Para contagem total em alimentos, laticínios e água, o PCA da Sora tem controle microbiológico publicado na ficha: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Lactobacillus casei ATCC 9595, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212 e Streptococcus pyogenes ATCC 19615, com inóculo de 50–100 UFC, crescimento abundante e recuperação ≥ 70% após 18–24 h a 35–37 °C. A Sora emite certificado de análise por lote, e o lote que você reidrata no seu laboratório continua sendo liberado pelo seu controle de qualidade.

Veja os meios selecionados para alimentos e laticínios, para água e efluentes e para o controle farmacêutico. Para revisar o POP de contagem ou escolher diluente e meio para o seu método, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas