Teste de esterilidade: tioglicolato e caseína-soja, o que a farmacopeia exige

O teste de esterilidade da farmacopeia usa dois meios líquidos: o meio fluido de tioglicolato, incubado a 30–35 °C, e o caldo caseína-soja, incubado a 20–25 °C, ambos por no mínimo 14 dias, depois de a amostra ser processada por filtração por membrana ou por inoculação direta. O texto é harmonizado entre a USP <71>, a Ph. Eur. 2.6.1 e a JP 4.06, e o guia ICH Q4B, Anexo 8, reconhece os três capítulos como intercambiáveis nas regiões ICH, nas condições descritas no anexo. No Brasil, a referência é o método geral de teste de esterilidade da Farmacopeia Brasileira, 8ª edição, em vigor desde 1º de julho de 2026 (na 6ª edição, o método era o 5.5.3.2.1).

Antes de qualquer detalhe, um ponto de método: o ensaio é feito numa amostra do lote e tem alcance estatístico limitado. Um resultado conforme só tem valor quando os meios foram qualificados e o método foi demonstrado adequado para aquele produto. É disso que trata a maior parte deste artigo.

Os dois meios e por que são dois

Cada meio cobre um grupo de microrganismos. O texto harmonizado diz que o meio fluido de tioglicolato se destina principalmente a bactérias anaeróbias, mas também detecta aeróbias; o caldo caseína-soja serve para fungos e bactérias aeróbias.

No tioglicolato, o tioglicolato de sódio e a L-cistina reduzem o potencial de oxirredução, a pequena quantidade de ágar limita a difusão de oxigênio e a resazurina indica a oxidação ao ficar rosa. Dois limites da farmacopeia valem para a rotina:

• ao fim da incubação, no máximo a metade superior do meio pode ter mudado de cor por absorção de oxigênio;
• se mais de um terço superior do meio estiver rosa antes do uso, ele pode ser restaurado uma única vez, por aquecimento em banho-maria ou vapor fluente até a cor desaparecer, com resfriamento rápido em seguida.

A Sora oferece os dois meios desidratados: o Meio Fluido de Tioglicolato (USP) e o Caldo Triptona de Soja (TSB), que é o caldo caseína-soja, com composição, pH e preparo publicados na ficha técnica.

Qualificação dos meios: esterilidade e promoção de crescimento

Os meios do ensaio precisam passar em dois testes, feitos antes ou em paralelo com o teste do produto.

Esterilidade do meio. Uma porção de cada lote esterilizado é incubada na temperatura do ensaio por 14 dias, sem crescimento.

Promoção de crescimento. Cada meio recebe no máximo 100 UFC de cada cepa, em porções separadas, com incubação de até 3 dias para bactérias e até 5 dias para fungos. O meio é aprovado se houver crescimento claramente visível.

As farmacopeias aceitam cepas equivalentes de outras coleções e citam alternativas em nota; confira a lista na edição vigente do compêndio que o seu dossiê adota. Para o preparo das suspensões, a confirmação do inóculo e os registros do teste, veja o artigo sobre o teste de promoção de crescimento em meios de cultura.

O prazo de uso do meio preparado depende da embalagem. Em recipientes não selados, ele pode ser usado por 1 mês, desde que a promoção de crescimento seja feita até 2 semanas antes do uso; em recipientes herméticos, por 1 ano, com promoção de crescimento até 3 meses antes do uso. Nos dois casos, o requisito de cor do indicador precisa ser atendido.

Teste de adequação do método (bacteriostase e fungistase)

O teste de adequação do método (method suitability test; validation test em edições antigas) demonstra que o produto não inibe o crescimento nas condições do ensaio. Ele é obrigatório quando o teste de esterilidade é aplicado a um produto novo e sempre que houver mudança nas condições experimentais.

Como é feito:

1. O ensaio é montado exatamente como será executado, com o produto.
2. Adiciona-se no máximo 100 UFC de cada cepa da promoção de crescimento: no último líquido de lavagem, na filtração por membrana, ou no meio que contém o produto, na inoculação direta.
3. Monta-se um controle igual, sem o produto.
4. Incuba-se por até 5 dias.

Se o crescimento for claramente visível e comparável ao do controle, o produto não tem atividade antimicrobiana nas condições do ensaio, ou ela foi eliminada. Se não for, a atividade bacteriostática ou fungistática precisa ser removida, com mais lavagens da membrana, maior diluição em mais volume de meio ou uso de neutralizante adequado, e o teste de adequação é repetido. Em auditoria, é esse registro que sustenta cada resultado negativo do produto.

Filtração por membrana ou inoculação direta

A filtração por membrana é a técnica preferencial sempre que a natureza do produto permite: preparações aquosas filtráveis, alcoólicas ou oleosas e preparações miscíveis ou solúveis em solventes sem efeito antimicrobiano. Ela separa os microrganismos do produto e, com isso, reduz o problema de inibição.

• Membrana: porosidade nominal de no máximo 0,45 µm.
• Lavagem: quando o produto tem atividade antimicrobiana, a membrana é lavada pelo menos 3 vezes, com o volume definido no teste de adequação; a farmacopeia fixa um teto para o ciclo de lavagem.
• Transferência: a membrana inteira vai para o meio ou é cortada assepticamente em duas metades iguais, uma para cada meio.

Na inoculação direta, o produto é transferido para os frascos de meio. O volume de produto não pode passar de 10% do volume de meio, salvo indicação em contrário. É a opção para o que não filtra, como pomadas não solúveis, dispositivos e materiais sólidos, mas tende a exigir mais diluição para neutralizar a atividade antimicrobiana.

Quantas unidades testar

O número mínimo de unidades por meio depende do tipo e do tamanho do lote, em tabela do capítulo. Para preparações parenterais:

A quantidade de produto por unidade e por meio segue outra tabela do mesmo capítulo, conforme o volume ou a massa de cada recipiente.

Incubação de 14 dias e leitura

Os meios inoculados são incubados por no mínimo 14 dias e examinados, em intervalos e ao final, quanto a sinais macroscópicos de crescimento.

Se o produto turvar o meio a ponto de impedir a leitura visual, aos 14 dias transferem-se porções de no mínimo 1 mL para frascos novos do mesmo meio, e os frascos originais e os de repique seguem incubados por no mínimo 4 dias.

Interpretação, invalidação e repetição

Sem crescimento, o produto cumpre o teste. Com crescimento, não cumpre, a menos que se demonstre que o ensaio é inválido. A farmacopeia restringe a invalidação a uma ou mais destas condições:

1. o monitoramento microbiológico da área de teste de esterilidade mostra falha;
2. a revisão do procedimento usado no ensaio revela falha;
3. há crescimento nos controles negativos;
4. após a identificação dos microrganismos isolados, o crescimento pode ser atribuído inequivocamente a falhas no material ou na técnica.

Se o ensaio for invalidado, ele é repetido com o mesmo número de unidades do original. Sem crescimento na repetição, o produto cumpre; com crescimento, não cumpre. Na prática, a invalidação depende da identificação do isolado e da comparação com os isolados do monitoramento ambiental e de pessoal; "contaminação do analista", sem evidência, não invalida o teste.

O que as fichas técnicas da Sora declaram

A Sora fornece os meios desidratados. O lote pronto para uso é preparado no seu laboratório, e a esterilidade do meio, a promoção de crescimento e a adequação do método são feitas por você, nas condições da farmacopeia.

• Meio Fluido de Tioglicolato (USP): pH 7,1 ± 0,2; meio preparado conservado em temperatura ambiente (15–25 °C), ao abrigo da luz. A ficha traz a mesma regra de restauração única do terço superior rosa e um controle microbiológico a 30–35 °C por no máximo 3 dias, com crescimento abundante declarado para C. sporogenes ATCC 19404 e ATCC 11437, P. aeruginosa ATCC 9027 e S. aureus ATCC 6538, entre outras cepas.
• Caldo Triptona de Soja (TSB): pH 7,3 ± 0,2; meio preparado conservado entre 2 e 8 °C. A ficha declara a promoção de crescimento nas condições de uso geral (30–35 °C) e o perfil de crescimento a 35–37 °C, com crescimento abundante de B. subtilis ATCC 6633 e C. albicans ATCC 10231, entre outras. No teste de esterilidade, o mesmo caldo trabalha a 20–25 °C e a qualificação inclui A. brasiliensis ATCC 16404: por isso, o seu laboratório qualifica o lote nas condições da <71>.

Os dados da ficha orientam a escolha do meio e das cepas, mas não substituem a qualificação exigida pela farmacopeia para o seu ensaio.

Veja a seleção completa para aplicação farmacêutica e esterilidade. Para montar ou revisar o método de esterilidade do seu laboratório, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas