Análise microbiológica da água: Portaria 888, coliformes totais, termotolerantes e E. coli

A análise microbiológica da água para consumo humano verifica, antes de tudo, a presença de coliformes totais e de Escherichia coli em 100 mL de amostra. No Brasil, o padrão está na Portaria GM/MS nº 888, de 4 de maio de 2021, que alterou o Anexo XX da Portaria de Consolidação GM/MS nº 5/2017: a água deve ter ausência de E. coli em 100 mL, e os coliformes totais devem estar ausentes em 100 mL na saída do tratamento. A E. coli indica contaminação fecal; os coliformes totais indicam falha de tratamento, de integridade da rede ou de higiene do reservatório.

Para chegar a esse resultado, o laboratório escolhe entre três famílias de métodos descritas no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater: tubos múltiplos (NMP), membrana filtrante e substrato enzimático, além do teste presença-ausência (P-A). Cada um usa meios de cultura diferentes.

O que a Portaria 888 exige na água potável

O Anexo 1 do Anexo XX traz o padrão bacteriológico, separado por ponto do sistema:

• E. coli: ausência em 100 mL, na saída do tratamento e no sistema de distribuição (reservatórios e rede).
• Coliformes totais na saída do tratamento: ausência em 100 mL.
• Coliformes totais no sistema de distribuição: o critério depende do porte do sistema. Em sistemas que abastecem menos de 20.000 habitantes, só uma amostra do mês pode ser positiva; nos que abastecem 20.000 habitantes ou mais, exige-se ausência em 100 mL em 95% das amostras examinadas no mês.

Resultado positivo para coliformes totais na rede não se resolve com uma segunda análise no mesmo frasco. A norma manda fazer recoleta no ponto positivo e coletar amostras extras a montante e a jusante dele. As recoletas não entram no percentual mensal, um resultado negativo na recoleta não anula o positivo original, e resultado positivo na própria recoleta não é tolerado.

Uma mudança relevante da versão de 2021: o texto deixou de prever a contagem de bactérias heterotróficas, que na versão anterior do Anexo XX servia como parâmetro de integridade da rede. Isso não torna o ensaio inútil, como mostramos adiante.

Coliformes totais, termotolerantes e E. coli: qual a diferença

A diferença está na temperatura de crescimento e no quanto cada grupo é específico de contaminação fecal.

Coliformes totais

São bacilos gram-negativos, não esporulados, que crescem na presença de sais biliares ou agentes tensoativos e fermentam a lactose com produção de ácido e gás a cerca de 35 °C. O grupo inclui gêneros como Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter, muitos deles presentes no solo e na vegetação. Por isso, coliforme total na água tratada não prova contaminação fecal, mas mostra que algo deixou entrar ou sobreviver bactéria onde não deveria.

Coliformes termotolerantes

São o subgrupo que fermenta a lactose com produção de gás a 44,5 °C em 24 horas. O antigo nome "coliformes fecais" caiu em desuso porque o subgrupo inclui cepas ambientais, como algumas de Klebsiella. O termo continua presente em outras normas, como a Resolução CONAMA nº 357/2005, que classifica os corpos d'água.

Escherichia coli

É o único membro do grupo cujo habitat é exclusivamente o intestino de humanos e de animais de sangue quente, como descreve a CETESB nas suas normas de ensaio. Além de fermentar lactose a 44,5 °C, E. coli produz a enzima β-glucuronidase, base dos métodos com MUG e dos substratos cromogênicos. Na água potável, é o indicador de contaminação fecal que a Portaria 888 adota.

Métodos de análise de coliformes na água

Tubos múltiplos e NMP (Standard Methods 9221)

A técnica dos tubos múltiplos inocula volumes ou diluições da amostra em séries de tubos e estima a densidade de coliformes pelo número mais provável (NMP). Ela tem três etapas.

1. Presuntiva: o Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) recebe a amostra em tubos com tubo de Durham invertido. O laurilsulfato de sódio inibe a flora não coliforme, e gás no Durham é o resultado presuntivo positivo. A ficha orienta usar o meio em concentração simples para inóculos de até 1 mL e em concentração dupla para 10 mL ou mais.
2. Confirmativa para coliformes totais: o crescimento dos tubos positivos passa ao Caldo Bile Verde Brilhante 2%, em que a bile e o verde brilhante inibem gram-positivos e muitos gram-negativos não coliformes. A ficha pede 118 °C por 15 minutos e alerta para não autoclavar em excesso, porque o verde brilhante desbota para amarelo.
3. Termotolerantes e E. coli: os mesmos tubos presuntivos são repicados em Caldo EC, cujo controle microbiológico é feito a 44,5 ± 0,2 °C por 24 horas, ou em Caldo EC com MUG. No EC com MUG, a β-glucuronidase de E. coli libera um composto fluorescente, lido em luz ultravioleta de 366 nm. O Standard Methods 9221 F descreve essa etapa a 44,5 ± 0,2 °C por 24 horas.

Membrana filtrante (Standard Methods 9222)

Na membrana filtrante, um volume conhecido de água (em geral 100 mL para água tratada) passa por uma membrana que retém as bactérias, e a membrana vai para a superfície de um meio seletivo. O resultado sai em UFC/100 mL e o método aceita volumes grandes, o que favorece água com baixa contaminação.

• Coliformes totais: o Ágar m-Endo LES é usado em duas etapas: a membrana fica cerca de 2 horas a 35 °C sobre um disco embebido em caldo LST e depois é transferida para o ágar, a 35 °C por 24 horas. Coliformes formam colônias com brilho metálico. A ficha recomenda contar membranas com 20 a 80 colônias de coliformes e não mais de 200 colônias no total. O meio não é autoclavado: é dissolvido por fervura e recebe etanol a 95% depois de resfriado a 45–50 °C.
• Termotolerantes: o Ágar Base m-FC é incubado a 44,5 °C, com ácido rosólico a 1% adicionado no preparo. No controle microbiológico da ficha, E. coli forma colônias azul-claras, enquanto Salmonella Typhimurium e Shigella flexneri são inibidas na temperatura elevada.
• Confirmação: o Ágar Endo serve para confirmar colônias presuntivas. Coliformes dão colônias rosadas e E. coli desenvolve o brilho de fucsina, verde metálico.

Os meios com fucsina básica pedem cuidado: as fichas classificam o corante como possível carcinógeno e recomendam evitar a inalação do pó. O Ágar Endo também deve ficar ao abrigo da luz.

Presença-ausência (P-A)

Quando a pergunta é só "tem ou não tem coliforme em 100 mL", o teste P-A dispensa a quantificação. O Caldo Presença-Ausência (P-A) é preparado em concentração tripla para receber os 100 mL de amostra, e a púrpura de bromocresol vira de púrpura para amarelo quando a lactose é fermentada. A ficha indica o meio para água de estações de tratamento e de sistemas de distribuição. O frasco positivo segue para confirmação e para a pesquisa de E. coli.

Substrato enzimático (Standard Methods 9223)

Os métodos de substrato definido detectam coliformes totais pela β-galactosidase e E. coli pela β-glucuronidase, com leitura de cor e fluorescência, em formato P-A ou quantitativo. São muito usados no controle de rotina. A Sora não fornece esses substratos; o laboratório que usa tubos múltiplos ou membrana encontra no catálogo os meios das etapas descritas acima.

Bactérias heterotróficas: ainda vale contar?

Mesmo fora da Portaria 888, a contagem de heterotróficas continua útil para avaliar biofilme em reservatórios, filtros e redes internas, e para monitorar sistemas de água em indústrias. O método é o Standard Methods 9215 (Heterotrophic Plate Count).

O Ágar R2A é o meio indicado para água potável tratada. Ele tem baixo teor de nutrientes, piruvato de sódio e amido para recuperar células estressadas pela desinfecção. A ficha registra três pontos práticos:

• o R2A rende mais em semeadura em superfície; o plaqueamento em profundidade é desaconselhado porque o choque térmico de 44–46 °C prejudica as células estressadas;
• amostras de campo podem exigir incubação de até 7 dias;
• cada lote novo deve ser comparado com o lote anterior usando água de torneira, porque o bom crescimento de cepas-controle saudáveis não garante a recuperação de células estressadas.

Para contagem em profundidade, o Ágar Padrão para Contagem é a opção nutritiva clássica.

Coleta: onde muitos resultados se perdem

Nenhum meio de cultura corrige uma amostra mal coletada. A seção 9060 do Standard Methods e o Guia nacional de coleta e preservação de amostras da CETESB e da ANA trazem os pontos essenciais:

• Frasco estéril com agente redutor, como o tiossulfato de sódio, para água com cloro residual. O tiossulfato neutraliza o cloro e impede que ele continue matando bactérias até a análise. Não enxágue o frasco.
• Espaço de ar de pelo menos 2,5 cm, para homogeneizar a amostra por agitação.
• Desinfecção da torneira e escoamento antes da coleta, para que a amostra represente a água da rede e não a da torneira.
• Transporte refrigerado e análise o quanto antes. O prazo máximo entre coleta e início da análise está no Standard Methods 9060 B e deve constar do POP do laboratório.

Controle de qualidade dos meios

Antes de liberar um lote, o laboratório confere pH e esterilidade e faz controle positivo e negativo com cepas de referência. As fichas da Sora publicam as cepas ATCC e o comportamento esperado de cada meio. No Caldo EC, por exemplo, E. coli ATCC 25922 cresce com gás a 44,5 °C e Klebsiella aerogenes ATCC 13048 é inibida. A Sora emite certificado de análise por lote do pó; o meio reidratado no laboratório é liberado pelo próprio laboratório. O roteiro de reidratação está em como preparar meio de cultura desidratado, e a lógica dos controles, em teste de promoção de crescimento em meios de cultura.

Resumo dos meios por etapa

Veja todos os meios da seleção para análise de água e dos meios para coliformes, com composição, preparo e controle microbiológico publicados na ficha técnica de cada um. Para montar o kit de meios do seu método ou revisar o POP de potabilidade, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas