Técnica de microtomia em parafina: ângulo de folga, espessura e banho-maria para cortes de 3 a 5 µm

A microtomia em parafina dá bons resultados quando cinco variáveis estão sob controle: bloco frio, navalha e bloco firmemente presos, ângulo de folga correto, espessura e ritmo constantes e banho-maria na temperatura certa para a parafina usada. Quase todo corte ruim vem de uma delas fora do lugar. Este guia segue a ordem do trabalho na bancada, do bloco à lâmina seca, e termina com um checklist para o procedimento operacional padrão (POP) de laboratórios de pesquisa, ensino, histotécnica e biotério.

Se o seu problema já é um defeito específico no corte (trepidação, estrias, compressão), vá direto ao guia de artefatos em cortes histológicos, que relaciona cada artefato à causa e à correção.

1. Preparo: bloco frio, desbaste e fixação

Resfrie o bloco antes de cortar

Bloco frio corta melhor: a parafina fica mais firme e a dureza dela se aproxima da do tecido, o que reduz a compressão e ajuda a formar a fita. Um POP de biobanco de pesquisa orienta deixar os blocos sobre placa fria ou bandeja de gelo por pelo menos 20 minutos antes do corte e devolvê-los ao gelo depois de algum tempo de desbaste ou corte. Em tecidos duros ou ressecados, o contato da face do bloco com gelo também hidrata a superfície.

Desbaste e corte fino são etapas diferentes

O desbaste (trimming) remove o excesso de parafina até expor a superfície completa do tecido. Ele é feito com avanço maior: o protocolo do laboratório de histologia da Universidade de Auckland usa 10 a 15 µm nessa fase. Ao se aproximar do tecido, reduza o avanço; desbaste grosso arranca fragmentos e deixa furos que aparecem depois nos cortes finos.

O corte fino é feito só depois, com o bloco novamente resfriado e um trecho do fio que não foi usado no desbaste. O desbaste desgasta a navalha; deslocar a lâmina no porta-navalha para um trecho intacto antes dos cortes definitivos evita riscos.

Fixação firme de bloco e navalha

Antes da primeira volta da manivela, confira:

• Micrótomo em superfície estável, sem alavancas ou manípulos frouxos;
• Navalha inserida no porta-navalha e travada;
• Bloco preso no porta-bloco, com a face paralela ao fio da navalha (a borda inferior e a superior do bloco precisam correr paralelas ao fio para a fita sair reta);
• Protetor de fio posicionado sempre que a navalha não estiver em uso.

Qualquer folga mecânica vira vibração, e vibração vira trepidação no corte.

2. Ângulo de folga não é o ângulo do fio

Esta é a confusão mais comum em treinamento, e vale fixá-la no POP.

• Ângulo do fio (bisel): é o ângulo entre as duas faces afiadas da própria lâmina. Vem de fábrica e não se ajusta no micrótomo. As navalhas para micrótomo da Sora, por exemplo, declaram ângulo de corte de 35 graus, que é esse ângulo do fio.
• Ângulo de folga (clearance angle): é o ângulo entre a face do bloco e a face inferior da navalha, ajustado no porta-navalha. Ele existe para que a navalha não encoste na face do bloco depois de passar por ela.

A literatura de revisão cita uma faixa de 3° a 8° para o ângulo de folga. A regra prática é usar o menor ângulo que ainda deixe folga:

• grande demais, a navalha raspa o bloco em vez de cortar e produz trepidação;
• pequeno demais, a face da navalha comprime o bloco, e aparecem cortes alternados grossos e finos ou cortes que grudam no bloco no retorno.

O valor exato depende do micrótomo e do porta-navalha, e o manual do equipamento prevalece. Registre no POP o ângulo acertado para cada combinação de micrótomo, porta-navalha e lâmina; ao trocar qualquer um deles, reavalie.

3. Espessura e velocidade

Espessura de rotina

Para cortes de parafina destinados a coloração de rotina, os protocolos consultados fixam 4 a 5 µm: é o valor de um capítulo de procedimentos histopatológicos da série Methods in Molecular Biology e do protocolo de Auckland; o POP de biobanco citado acima usa 4 µm para hematoxilina e eosina. Laboratórios de apoio à pesquisa trabalham também com 3 a 4 µm para hematoxilina e eosina e para imuno-histoquímica, como o núcleo de patologia do Baylor College of Medicine: cortes mais finos reduzem a sobreposição de células. Técnicas específicas podem pedir outra espessura; quem define é o protocolo da coloração, não a navalha.

Um ponto importante para o POP: a espessura real do corte depende do micrótomo, da temperatura do bloco e da técnica do operador. Ajustar o valor no seletor não garante, sozinho, o corte nessa espessura.

Velocidade e ritmo

Gire a manivela em velocidade moderada e constante. Corte rápido demais favorece trepidação e furos; corte irregular produz espessura irregular ao longo da fita. Evite parar no meio de uma passada.

4. Formação da fita

Com bloco frio, face paralela ao fio e ritmo constante, cada corte adere pela borda ao corte anterior e forma a fita. À medida que ela cresce, sustente a ponta com pinça, pincel ou sonda e afaste-a suavemente da navalha, sem tracionar. Fita torta indica, em geral, bordas do bloco não paralelas ao fio; fita que não se forma costuma indicar bloco quente ou parafina mole. Para os demais defeitos, consulte o guia de artefatos.

5. Banho-maria: transferência e temperatura

Transfira a fita para a superfície da água com o lado brilhante (o que ficou voltado para a navalha) para baixo, depositando-a sem formar bolhas. Use água destilada ou purificada e mantenha a superfície limpa entre um bloco e outro, para não carregar fragmentos de um caso para o seguinte.

Qual temperatura usar

A referência é a parafina, não um número fixo. A National Society for Histotechnology (NSH) orienta manter o banho 5 a 10 °C abaixo do ponto de fusão da parafina em uso; o ponto de fusão vem na embalagem ou na ficha técnica dela. Na prática, os protocolos institucionais consultados trabalham na faixa de 40 a 45 °C (POP de biobanco) e 45 a 48 °C (Auckland), o que ilustra como o valor muda conforme a parafina e o laboratório.

• Água fria demais: o corte não se distende e ficam rugas.
• Água quente demais: a parafina amolece em excesso e o tecido se deforma.
• Flutuação prolongada: distende demais o corte. Separe as secções com pinça ou agulha e recolha sem demora.

6. Recolha na lâmina

Mergulhe a lâmina identificada em ângulo, encoste-a numa das bordas do corte e retire-a puxando suavemente, também em ângulo, para que o corte assente sem rugas. Confira se não ficou bolha de ar sob o tecido: área com bolha não adere e cora de forma desigual.

A escolha da lâmina faz parte do POP: o protocolo de Auckland cita lâminas lisas, com carga (positivamente carregadas) ou com revestimento adesivo. Técnicas com tratamentos mais agressivos, como recuperação antigênica por calor, costumam exigir lâmina com carga ou adesivo para o corte não se soltar.

7. Secagem

Deixe a lâmina escorrer na vertical, em suporte, para a água sair de baixo do corte. Depois, seque conforme a coloração prevista: o protocolo de Auckland usa estufa a 60 °C por 1 hora; o POP de biobanco admite secagem à temperatura ambiente, a 37 °C ou a 60 °C, conforme o procedimento seguinte. Defina no POP a condição para cada técnica e não a altere sem registrar.

Checklist para o POP de microtomia em parafina

1. Equipamento: micrótomo estável, sem folgas; manual consultado para ângulo de folga e travas.
2. Banho-maria: ligado antes, com água destilada, temperatura 5 a 10 °C abaixo do ponto de fusão da parafina em uso.
3. Blocos: resfriados (ao menos 20 min em placa fria ou gelo) e devolvidos ao frio durante a sessão.
4. Lâminas: identificadas antes do corte; tipo (lisa, com carga, adesiva) definido pela técnica.
5. Navalha: travada; protetor de fio em uso; trecho separado para desbaste e para corte fino.
6. Ângulo de folga: valor registrado para a combinação micrótomo, porta-navalha e lâmina.
7. Desbaste: avanço maior até expor o tecido, reduzindo ao se aproximar dele.
8. Corte fino: espessura definida pelo protocolo da coloração; ritmo moderado e constante.
9. Fita e banho: fita sustentada sem tração; transferência sem bolhas; separação das secções e recolha sem demora.
10. Secagem: escorrer na vertical e secar na condição definida para a técnica.
11. Encerramento: navalhas descartadas em recipiente para perfurocortantes; micrótomo limpo de resíduos de parafina; volante travado.
12. Registro: anotar desvios e correções, para que a próxima falha seja resolvida mais rápido.

Navalha: perfil e troca

A navalha descartável elimina a variável de afiação e permite trocar o trecho do fio entre desbaste e corte fino. As navalhas para micrótomo da Sora são de aço inoxidável X46Cr13 com revestimento de PTFE, em caixa dispensadora com 50 unidades, compatíveis com a maioria dos micrótomos e criostatos de bancada, em dois perfis: perfil alto (SS 258-A, 80 × 14 × 0,325 mm), mais rígido, indicado para blocos maiores, amostras duras e tecido ósseo descalcificado; e perfil baixo (SS 258-B, 80 × 8 × 0,25 mm), a escolha usual para cortes finos seriados em tecidos moles. O porta-navalha precisa aceitar o perfil escolhido.

Para padronizar o POP do seu laboratório ou tirar dúvidas sobre o perfil adequado ao seu micrótomo, fale com a equipe técnica da Sora.

Referências bibliográficas e normas técnicas